在化学中，分光光度法（Spectrophotometry）是对材料的反射或透射性质作为波长的函数的定量测量。 它比通用术语电磁光谱法更具体，因为分光光度法涉及可见光，近紫外和近红外，但不包括时间分辨光谱技术。

概观
分光光度法是一种取决于有色化合物吸收多少光的分子定量分析的工具。 分光光度法使用称为分光光度计的光度计，它可以测量作为其颜色（波长）的函数的光束强度。 分光光度计的重要特征是光谱带宽（可通过测试样品传输的颜色范围），样品传输百分比，样品吸收的对数范围以及有时反射率测量的百分比。

分光光度计通常用于测量溶液，透明或不透明固体如抛光玻璃或气体的透射率或反射率。 尽管许多生物化学物质是有色的，但是它们吸收可见光并且因此可以通过比色法测量，甚至无色的生物化学物质通常可以转化为适用于显色成色反应的着色化合物，以产生适用于比色分析的化合物。 但是，它们也可以设计为使用不同的控制和校准来测量通常覆盖约200nm-2500nm的任何列出的光范围的扩散率。 在这些光照范围内，机器需要根据光度测定的波长使用不同类型的标准进行标定。

使用分光光度法的实验的一个例子是确定溶液的平衡常数。 溶液中的某种化学反应可能发生在正向和反向，其中反应物形成产物并且产物分解成反应物。 在某种程度上，这种化学反应将达到称为平衡点的平衡点。 为了确定此时反应物和产物的相应浓度，可以使用分光光度法测试溶液的透光率。 通过溶液的光量指示不允许光通过的某些化学物质的浓度。

光的吸收归因于光与分子的电子和振动模式的相互作用。 每种类型的分子都有一组独立的能级，与其化学键和原子核的组成有关，因此会吸收特定波长或能量的光，从而产生独特的光谱特性。 这是基于其具体和独特的构成。

分光光度计的使用跨越各种科学领域，如物理学，材料科学，化学，生物化学和分子生物学。 它们广泛用于半导体，激光和光学制造，印刷和法医检验等许多行业以及化学物质研究实验室。 分光光度法经常用于测量酶活性，确定蛋白质浓度，确定酶动力学常数以及测定配体结合反应。 最终，分光光度计能够根据控制或校准确定目标中存在哪些物质，以及通过计算观察到的波长的精确程度。

在天文学中，术语分光光度法是指测量天体的光谱，其中光谱的通量标度作为波长的函数进行校准，通常通过与分光光度标准恒星的观察进行比较，并对吸收进行校正地球大气层的光线。

历史
到1940年，市场上有几种分光光度计，但早期的模型不能用于紫外线。 Arnold O. Beckman在国家技术实验室公司，后来的贝克曼仪器公司以及Beckman Coulter最终开发了一个改进版本。 模型A，B和C被开发出来（三个单元的模型C被生产出来），然后是模型D，它变成了DU。 所有的电子元件都包含在仪器箱内，它有一个紫外线连续的新氢灯和一个更好的单色器。 这种乐器从1941年开始生产，直到1976年，其设计基本相同; 超过30,000人被出售。 1941年的价格是723美元（远紫外线附件是一个额外成本的选择）。 诺贝尔化学奖获得者布鲁斯梅里菲尔德说，它“可能是有史以来最重要的仪器，用于推动生物科学发展。”

设计
有两大类设备：单光束和双光束。 双光束分光光度计比较两条光路之间的光强度，一条路径包含参考样本，另一条路径包含测试样本。 单光束分光光度计在插入测试样品之前和之后测量光束的相对光强度。 尽管来自双光束仪器的比较测量更容易且更稳定，但单光束仪器可以具有更大的动态范围并且光学更简单且更紧凑。 另外，由于实用性，一些专门的仪器，如建立在显微镜或望远镜上的分光光度计，都是单光束仪器。

历史上，分光光度计使用含有衍射光栅的单色器来产生分析光谱。 光栅可以是可移动的或固定的。 如果使用单个检测器，如光电倍增管或光电二极管，则可以逐步扫描光栅，以便检测器可以测量每个波长（对应于每个“阶跃”）的光强度。 也可以使用检测器阵列，如电荷耦合器件（CCD）或光电二极管阵列（PDA）。 在这样的系统中，光栅是固定的，并且每个波长的光的强度由阵列中的不同探测器测量。 另外，大多数现代中红外分光光度计都使用傅里叶变换技术来获取光谱信息。 这种技术被称为傅里叶变换红外光谱。

在进行透射率测量时，分光光度计定量比较通过参比溶液和测试溶液的光线比例，然后以电子方式比较两个信号的强度，并计算样品与参考标准相比的透射百分比。 对于反射比测量，分光光度计定量比较参考样品和测试样品反射的光线比例。 来自光源灯的光线通过单色器，通过旋转棱镜将光衍射成波长“彩虹”，并通过单色器输出侧的机械狭缝输出该衍射光谱的窄带宽。 这些带宽通过测试样本传输。 然后用光电二极管，电荷耦合器件或其他光传感器测量透射光或反射光的光子通量密度（通常每平方米的瓦数）。 然后将测试样品的每个波长的透射率或反射率值与来自参考样品的透射率或反射率值进行比较。 大多数仪器将对线性透射比应用对数函数来计算样品的“吸光度”，该值与被测化学物质的“浓度”成正比。

简而言之，现代分光光度计的事件顺序如下：

光源照射到单色器中，衍射成彩虹，并分成两束。 然后通过样品和参考溶液进行扫描。
入射波长的分数透过样本和参考，或从样本和参考反射。
所产生的光照射到光电探测器装置，该装置比较两个光束的相对强度。
电子电路将相对电流转换为线性透射百分比和/或吸光度/浓度值。
许多较老的分光光度计必须通过称为“调零”的程序进行校准，以平衡检测器处两个光束的零电流输出。 参考物质的传输被设置为基准（基准）值，因此所有其他物质的传输都相对于初始“归零”物质进行记录。 然后分光光度计将透射比转换成“吸光度”，即测试样品相对于初始物质的特定成分的浓度。

生物化学应用
分光光度法是许多生物化学实验中使用的重要技术，涉及DNA，RNA和蛋白质分离，酶动力学和生物化学分析。 分光光度测定法的简要说明包括比较不含有色化合物的空白样品与含有有色化合物的样品的吸光度。 这种着色可以通过在595nm下测量的诸如Coomasie Brilliant Blue G-250染料的染料或通过在420nm处测得的β-半乳糖苷酶和ONPG（变成样品黄色）之间的酶促反应来完成。 分光光度计用于测量可见光区域（350 nm至800 nm）内的有色化合物，因此可用于查找有关所研究物质的更多信息。 在生物化学实验中，选择化学和/或物理性质，并且所使用的程序对于该性质是特定的，以便获得关于样品的更多信息，例如数量，纯度，酶活性等。可以使用分光光度法对于许多技术来说，例如确定样品的最佳波长吸光度，确定样品吸光度的最佳pH值，确定未知样品的浓度，以及确定各种样品的pKa。 分光光度法也是一种有用的蛋白质纯化方法，也可用作制造化合物光学分析的方法。 分光光度数据也可以与Beer-Lambert方程结合使用，A = -log10T =εcl= OD，以便确定透光率和浓度以及吸光度和浓度之间的各种关系。 由于分光光度计通过其颜色测量化合物的波长，因此可以添加染料结合物质，以便可以进行颜色变化并进行测量。 可以使用每种组分的标准溶液的吸收光谱知道双组分混合物的浓度。 要做到这一点，有必要知道这种混合物在两种波长下的消光系数和含有两种成分已知重量的溶液的消光系数。 分光光度计已经开发并改进了数十年，并已在化学家中广泛使用。 此外，分光光度计专门用于测量UV或可见光波长吸光度值。 它被认为是一种非常精确的仪器，非常灵敏，因此非常精确，特别是在确定颜色变化时。 这种方法也适用于实验室实验，因为它是一种廉价且相对简单的方法。

紫外可见分光光度法
大多数分光光度计都用于光谱的紫外和可见光区域，其中一些仪器也可用于近红外区域。 由于存在色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，通过测量280nm处的OD可以估计蛋白质的浓度。 这种方法不是很准确，因为蛋白质的组成变化很大，没有这些氨基酸的蛋白质在280nm处没有最大吸收。 核酸污染也会干扰。 这种方法需要分光光度计能够在紫外区测量石英比色皿。

紫外 – 可见（UV-vis）光谱涉及激发电子跃迁的能级。 紫外可见光的吸收激发处于基态的分子到它们的激发态

可见光区域400-700 nm分光光度法广泛用于比色法科学。 这是一个众所周知的事实，它的最佳操作范围为0.2-0.8 OD油墨制造商，印刷公司，纺织品供应商等等都需要通过比色法提供数据。 他们在沿着可见区域每5-20纳米的区域内读取读数，并产生光谱反射曲线或替代演示的数据流。 这些曲线可用于测试新批次的着色剂，以检查它是否与规格匹配，例如ISO打印标准。

传统的可见光区域分光光度计无法检测着色剂或基材是否具有荧光。 如果例如一种或多种印刷油墨是荧光的，则这可能使得难以管理颜色问题。 在着色剂含有荧光的情况下，使用双光谱荧光分光光度计。 可见光谱分光光度计有两种主要设置，d / 8（球形）和0/45。 名称是由于光源，观察者和测量室内部的几何形状。 科学家使用该仪器来测量样品中化合物的量。 如果化合物浓度更高，更多的光将被样品吸收; 在小范围内，Beer-Lambert定律成立，样品之间的吸光度随浓度线性变化。 在打印测量的情况下，通常使用两种替代设置 – 没有/使用uv过滤器来更好地控制纸张内的uv光亮剂的效果。

样品通常在比色杯中制备; 取决于感兴趣的区域，它们可以由玻璃，塑料（感兴趣的可见光谱区域）或石英（感兴趣的远紫外光谱区域）构建。

应用
估算溶解有机碳浓度
用于度量芳香性的特定紫外吸光度
Bial对戊糖浓度的测试
实验应用
如应用部分所述，分光光度法可用于DNA，RNA和蛋白质的定性和定量分析。 可以使用定性分析，并使用分光光度计通过扫描宽波长区域来记录化合物的光谱，以确定化合物在每个波长处的吸光度性质（颜色的强度）。 一个可以证明可见分光光度法可以具有的各种用途的实验是从各种蛋白质混合物中分离β-半乳糖苷酶。 很大程度上，分光光度法最适用于量化样品相对于总蛋白质浓度的纯化量。 通过运行亲和层析，您可以分离B-半乳糖苷酶，并且可以通过将收集的样品与ONPG反应并确定样品是否变黄来进行测试。 在420nm处测试与ONPG的特异性相互作用的样品，并且在595处进行Bradford测定，可以定量评估纯化的量。 除此之外，分光光度法还可以与SDS-Page电泳等技术串联使用，以纯化和分离各种蛋白质样品。

红外分光光度法
由于该地区的测量技术要求，为红外区域设计的分光光度计有很大不同。 其中一个主要因素是可用于不同光谱区域的光电传感器类型，但红外线测量也具有挑战性，因为几乎所有情况下都会发射红外光作为热辐射，尤其是在波长超过5微米的情况下。

另一个复杂因素是，诸如玻璃和塑料之类的不少材料吸收红外光，使其不兼容作为光学介质。 理想的光学材料是不吸收强烈的盐。 用于IR分光光度测定的样品可以涂抹在两片溴化钾圆片之间或用溴化钾研磨并压成颗粒。 在要测量水溶液的情况下，使用不溶的氯化银来构建细胞。

光谱仪
分光辐射计的工作原理与可见光区域分光光度计一样，可用于测量光源的光谱密度。 应用程序可能包括评估和分类制造商销售的照明，或者让客户确认他们决定购买的灯泡是否符合其规格。 组件：

光源照射或通过样品。
样本透射或反射光线。
检测器检测从样品反射或透过样品的光量。
探测器然后将样本发射或反射的光数转换为数字。