3D生物打印

三维生物打印(3D bioprinting)是利用3D打印和3D打印技术将细胞,生长因子和生物材料组合在一起,以制造最大限度模仿自然组织特征的生物医学部件。 通常,3D生物打印利用逐层方法来沉积称为生物链接的材料以产生组织样结构,其随后用于医学和组织工程领域。 生物打印涵盖了广泛的生物材料。

目前,生物打印可用于打印组织和器官,以帮助研究药物和药丸。 然而,新兴创新的范围从细胞的生物打印或细胞外基质逐层沉积到3D凝胶中以产生所需的组织或器官。 最近3D打印普及的爆发证明了这项技术的前景及其在研究和再生医学中的深远功效。 此外,3D生物打印已开始结合支架的印刷。 这些支架可用于再生关节和韧带。

定义
3D生物印刷是使用3D打印技术在狭窄空间中创建细胞结构的过程,其中细胞功能和活力保留在印刷构造中。 通常,3D生物印刷使用逐层印刷方法来沉积有时被称为生物塑料的材料以产生类似于天然生物组织的结构,然后将其用于医学工程和组织领域9.生物印刷使用种类繁多的材料。 目前,生物印刷可用于印刷组织和器官,尤其是用于药物研究。 与该技术相关的第一项专利于2003年在美国提交,并于2006年授予。

生物印刷处于许多领域的界面:医学,工程学,计算机科学,基因工程等。生物组织由由有机和无机细胞外基质组成的硬组织和由细胞形成的软组织组成。 从干细胞印刷活细胞物质。 它沉积在生物墨水的液滴中,这些液滴将形成连续的层并且在叠加时将构成三维的生物组织。 为了生产生物墨水,人们可以使用患者的干细胞来生长(创建一平方毫米的组织需要数百万)。 干细胞悬浮在可在室温下修饰的特定培养基中。 织物印花的支撑物是一层薄薄的胶原蛋白(人体中最丰富的蛋白质,负责组织内聚力),可以与传统印花机的纸张进行比较。 除细胞和生物材料外,生物打印机还必须包含一系列生物化学物质(即趋化因子,生长因子,粘附因子或信号蛋白),以促进生存,运动和细胞分化的环境。

通过3D生物印刷印刷织物时可以区分几个阶段。 这三个连续的技术步骤是预处理,处理(印刷)和后处理:
该设计或多或少与原始组织相同,然后是模型的计算机设计,其将根据第一步中表达的特征来定义如何逐层打印干细胞。 该步骤与第三步骤相结合,即通过专用软件对打印机进行编程,该软件将要执行的动作转换为打印机语言。 这两个步骤类似于从塑料3D打印机设计对象的步骤。
由打印机自动打印织物,根据所使用的技术而不同。

生物印刷中的两个关键参数是密度和分辨率。 细胞的密度是生物墨水中的密度。 如果它太低,那么最后阶段将不会很好,并且织物将不可行。 分辨率是打印机放置单元格的精度。 如果精度不是最佳的,那么细胞的预定结构将不被尊重并且组织将不具有正确的形状,同时防止细胞发育的最终阶段的良好进展。

最后一步是印花织物的成熟。 这是组装的细胞将进化并相互作用以形成连贯且有活力的组织的阶段。 在生物反应器内的后印刷过程中,组织经历快速成熟,包括多级血管化和神经支配的发展,增加了用于移植的组织的强度和机械完整性。 放置在孵化器中,组织发育形成连贯的组织。 该阶段在印刷后约48小时开始,并且可以持续数周,具体取决于织物的尺寸。 在成熟阶段,我们可以谈论4D打印,因为打印后的时间尺寸是必不可少的。

生物反应器通过提供对流营养素,创造微重力环境和促进细胞中溶液的循环来提供有利于组织发育的环境。 存在适用于不同类型组织的不同类型的生物反应器,例如,压缩生物反应器对于软骨组织是理想的。

技术
用于制造人造器官的3D打印已成为生物工程研究的主要课题。 随着3D打印制造技术变得越来越有效,它们在人造器官合成中的适用性变得更加明显。 3D打印的主要优点在于其可定制的复杂结构的批量生产能力以及获得的高解剖精度。 3D生物印刷在定位细胞和生物材料方面提供了前所未有的多功能性,可以精确控制其成分,空间分布和建筑精度,从而可以对印花织物和器官的最终形状,结构,微观结构和结构进行详细甚至个性化的重建。

与非生物3D打印相比,3D生物打印引起额外的复杂性,例如材料选择,细胞类型,生长和分化因子以及与细胞敏感性相关的技术挑战。 生活和织物结构。

使用3D打印的印刷机构可以使用各种技术进行,每种技术都具有可以针对特定类型的器官生产而定制的特定益处。

传统的组织工程方法是将细胞接种在基质支架上,即包含互连孔网络的固体支持结构。 该结构必须保持合成组织的形状和机械性质,并通过提供细胞增殖的底物来辅助细胞附着。 3D打印技术是最近的一项创新,它允许同时播种活细胞并在层中创建生物材料结构。

三种最流行的3D生物打印技术是激光打印技术,微挤压技术和喷墨技术。 除了这些技术之外,剑桥的一个研究小组正在开发一种声学打印机,其中波浪振动生物颗粒,这将导致液滴以精确的细胞大小喷射。 今天,在互联网上,您可以找到有关如何使用TeVido BioDevices网站上提供的办公室打印机HP生产自己的生物打印机的说明。

每种技术对于硬质生物组织工程和器官的印刷都有利有弊。 人体的硬组织包括骨骼,牙齿和软骨,并且由一些类型的单细胞和显着比例的有机和无机细胞外基质组成。

激光打印
这项最新技术需要在波尔多的INSERM进行10年的研究。 该技术适用于激光原理。 激光通过镜子引导,穿过镜片,然后聚焦,撞击盖玻片,在盖玻片上放置生物墨水膜。 在激光/药筒相互作用期间,在支持物上滴下含有少量细胞的微滴,精确度为5微米。 打印速度足够快。 实验甚至表明,由于体内印象(直接在生物的皮肤上),它适用于老鼠。 通过每秒10,000个脉冲的激光扫描获得细胞的图案,每个脉冲产生微滴。 该技术是唯一一种具有单位分辨率(逐个单元)的技术,每个微滴高达50个单元。 这种精确度使得可以在三维中复制复杂的生物组织,例如皮肤样本。

激光打印结合了分辨率和密度(约108细胞/ ml的生物墨水),具有多种优势。 激光生物印刷的三个好处是95%以上的细胞活力,减少浪费和无机械应力。 这是由于脉冲的短暂,几纳秒,最大限度地减少了电池变暖并减少了它们的“压力”。 然而,印花织物的可行性取决于施加在细胞上的应力。 重要的是细胞是最不可能“降解”的。

然而,一些因素仍有待改进,因为机器还没有以良好组织的方式堆叠多层电池,准备时间很长并且印刷成本也很高。

喷墨
该技术特别用于Tedivo Biodevices DIY打印机。 这项技术适用于英国曼彻斯特大学。 喷墨打印机与打印头一起工作,该打印头投射含有细胞的液体(生物墨水)的微滴。 液滴的喷射是由热(热)或压电过程(油墨在机械应力作用下的电极化)引起的。 墨水在20°时是液体,但在36°的温度下凝胶化。 该过程与3D塑料打印机最相似。

该技术是最经济实惠且易于使用的,具有最少的准备时间和低成本。 印刷时间短,细胞活力大于85%,但分辨率差,导致细胞发育不良。 此外,密度也是一个难以管理的参数,它通常太低或非常低(约106个细胞/毫升,比激光打印机少100倍)。 这些缺点使得它目前不适合印刷复杂的织物,它仅用于印刷图案,这要归功于要印刷的细胞。

微挤压
微挤出(也称为生物挤出)是美国公司Organovo开始实现工业化的唯一方法,其打印机Novogen MMX与密苏里大学合作开发并于2005年开发。

此打印机使用两个打印头。 一个沉积凝胶,另一个沉积细胞。 将细胞推入微型注射器中并使用针头沉积。 交替沉积各层,水凝胶层(水混合物),然后是一层细胞。 水凝胶用于构建细胞层的组装,类似于脚手架。 然后水凝胶在成熟阶段溶解,使细胞融合在一起。 生物挤出使得可以获得高密度但具有平均分辨率(范围从5微米到几毫米宽)。 与其他技术相比,准备时间是平均的,但印刷时间更长(非常慢)。 这种类型的打印机的成本是中等的,并且电池的可行性(在打印后和成熟阶段“存活”的能力)在40%到80%之间,与其他技术相比这个速度很低,这方面仍然是改进。

混合技术
今天这些技术的可能性有限,但一些研究人员正在研究“混合打印机”。 该技术仍处于测试阶段,但在美国,研究人员成功地将细胞印刷和可生物降解聚合物(由重复一个或多个原子或原子团的特征组成的分子组成的物质结合在一起,这些原子可能是天然的,合成的或人工)形成软骨。

Bioprinters
市场上有不同的生物打印机。 价格从BioBot 1的10,000美元到EnvisionTec的3D-Bioplotter的200,000美元不等。 Aether 1生物打印机预计将于2017年以9,000美元的价格上市。 在实践中,研究人员经常开发自己的实验性生物打印机。

处理
3D生物打印通常遵循三个步骤,即生物前打印,生物打印和生物打印后。

预生物打印
预生物打印是创建模型的过程,打印机稍后将创建并选择将要使用的材料。 最初的步骤之一是获得器官的活组织检查。 用于生物打印的常用技术是计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)。 为了使用逐层方法进行打印,对图像进行断层摄影重建。 然后将现在的2D图像发送到打印机进行制作。 创建图像后,某些单元格被隔离并相乘。 然后将这些细胞与特殊的液化物质混合,提供氧气和其他营养物质,使它们保持活力。 在一些过程中,细胞被包封在直径为500μm的细胞球体中。 这种细胞聚集不需要支架,并且需要用于管状组织融合以进行诸如挤出的过程。

生物打印
在第二步中,将称为bioinks的细胞,基质和营养素的液体混合物置于打印机盒中,并使用患者的医学扫描进行沉积。 当生物打印的预组织转移到培养箱时,这种基于细胞的预组织成熟为组织。

用于制造生物构建体的3D生物打印通常涉及使用连续的逐层方法将细胞分配到生物相容性支架上以产生组织样三维结构。 通过3D生物打印制造的诸如肝脏和肾脏的人造器官已被证明缺乏影响身体的关键因素,例如工作血管,用于收集尿液的小管以及这些器官所需的数十亿细胞的生长。 如果没有这些成分,身体就无法在其内部深处获得必需的营养和氧气。 鉴于体内的每个组织天然地由不同的细胞类型组成,用于印刷这些细胞的许多技术在制造过程中确保细胞稳定性和活力的能力各不相同。 用于细胞的3D生物打印的一些方法是光刻,磁性生物打印,立体平板印刷和直接细胞挤出。

后生物打印
后生物打印过程对于从生物材料产生稳定结构是必要的。 如果该过程没有得到良好维护,则3D打印物体的机械完整性和功能将受到威胁。 为了保持物体,需要机械和化学刺激。 这些刺激将信号发送到细胞以控制组织的重塑和生长。 此外,在最近的发展中,生物反应器技术允许组织的快速成熟,组织的血管形成和移植存活的能力。

生物反应器可以提供对流养分输送,创建微重力环境,改变压力导致溶液流过细胞,或增加动态或静态负载的压缩。 每种类型的生物反应器都适用于不同类型的组织,例如压缩生物反应器是软骨组织的理想选择。

生物打印方法
该领域的研究人员已经开发出生产具有适当生物和机械特性的活体器官的方法。 3D生物打印基于三种主要方法:仿生学,自主自组装和小组织构建块。

仿生学
生物打印的第一种方法称为仿生学。 这种方法的主要目标是创造与人体组织和器官中发现的天然结构相同的制造结构。 仿生学需要重复器官和组织的形状,框架和微环境。 仿生学在生物打印中的应用涉及产生器官的相同细胞和细胞外部分。 为了使这种方法成功,组织必须在微观尺度上复制。 因此,有必要了解微环境,微环境中生物力的性质,功能和支持细胞类型的精确组织,溶解因子和细胞外基质的组成。

自主自组装
生物打印的第二种方法是自主自组装。 该方法依赖于胚胎器官发育的物理过程作为复制感兴趣组织的模型。 当细胞处于早期发育阶段时,它们会创建自己的细胞外基质构建块,正确的细胞信号传导,以及独立的排列和图案化,以提供所需的生物学功能和微观结构。 自主自组装需要关于胚胎组织和器官的发育技术的具体信息。 有一种“无支架”模型使用自组装球体,其融合和细胞排列类似于进化组织。 自主自组装依赖于细胞作为组织发生的基本驱动因素,指导这些组织的构建模块,结构和功能特性。 它需要更深入地了解胚胎组织机制如何发展以及围绕创建生物打印组织的微环境。

小型组织
生物打印的第三种方法是生物模拟和自组装方法的组合,称为迷你组织。 器官和组织由非常小的功能组件构成。 迷你组织方法采用这些小块并制造并将它们安排到更大的框架中。

打印机
类似于普通的墨水打印机,生物打印机有三个主要组成部分。 这些是使用的硬件,生物墨水的类型,以及它上印刷的材料(生物材料)。 “生物墨水是一种由活细胞制成的材料,其表现形式与液体非常相似,允许人们”打印“它以形成所需的形状。为了制造生物墨水,科学家们创造了一种细胞浆,可以装入一个墨盒,插入一个专门设计的打印机,以及另一个装有生物纸凝胶的墨盒。“

在生物打印中,有三种主要类型的打印机已被使用。 这些是喷墨,激光辅助和挤出打印机。 喷墨打印机主要用于快速和大规模产品的生物打印。 一种称为按需喷墨打印机的喷墨打印机可以精确打印材料,最大限度地降低成本和浪费。 利用激光的打印机提供高分辨率打印; 然而,这些打印机通常很昂贵。 挤出打印机逐层打印单元,就像3D打印一样,可以创建3D结构。 除了细胞外,挤出印刷机还可以使用注入细胞的水凝胶。

应用
近几十年来,再生医学领域在其生产生物组织的功能性替代物的能力方面取得了相当大的进步。 尽管十多年来,活细胞和生物材料(通常是水凝胶)已经通过生物印刷进行印刷,但基于细胞外基质和微工程的29种常规方法仍然限制了它们产生具有精确仿生特性的组织的能力。

2013年,Organovo通过生物印刷技术生产人体肝脏。 然而,身体不适合移植,主要用作筛查药物的手段30。

2017年使用生物印刷
生物打印已经可以创造生命结构。 在世界各地的许多实验室中印刷细胞生物物质,细胞组织是可行的,生物印刷不影响细胞分化。 一些技术已经在医学治疗中得到应用并取得了一些成功。 3D生物印刷已经用于生产和移植几种组织,包括多层皮肤,骨,血管移植物,气管假体,心脏组织和软骨结构。

复杂器官的印刷是全世界深入研究的主题。 例如,心脏,胰腺,肝脏或肾脏。 从2017年开始,这项研究尚未导致移植。

2017年5月,研究人员利用bioimpression生产小鼠卵巢。 植入人工卵巢的无菌小鼠能够排卵,传递和喂养正常健康的小鼠。 该研究是第一个在3D打印的帮助下实现这一结果的研究。

目前皮肤的进步。
研究人员设法打印出不同的结构和细胞类型:多层角质形成细胞(皮肤浅层细胞和浅表体生长:指甲,毛发,头发)和胶原蛋白。

2010年,波尔多实验室设法直接在带有小孔的活鼠的头骨上印刷骨细胞(以更新和巩固骨组织)。 在直接在患者身上打印的情况下,我们谈到体内打印。 研究人员使用相同的原理通过去除后来印刷的间充质细胞来印刷骨骼部分和部分皮肤。 间充质细胞可以产生几种类型的属于骨骼组织的细胞,例如软骨,骨和脂肪。 它们存在于胚胎的间充质中,并且在成人中非常少量。 医生.Fabien Guillemot评论了对老鼠的第一次测试:“获得的结果是非常确定的。印刷的细胞保留了它们的所有功能并且在印刷后两个月成倍增加。第一个受试者显示出愈合的迹象。汉诺威激光中心的结果相同。德国:面料修复动物的伤口,没有任何拒绝。

美国公司Organovo销售用于医学研究的印刷皮肤样品。 制药公司使用这些功能性有机组织来测试治疗效果及其对疾病的影响。 该公司还印刷病变组织模型,以更好地了解疾病及其演变。 目标还在于测试药物分子的有效性并降低临床试验的成本。 大型化妆品团体也使用样品来评估营销前的护理毒性,并寻找自2013年以来在欧洲被禁止的动物试验的替代品。

目前重要器官的进展
已经开发出新技术来克服印刷组织的血管形成问题。 一种技术实际上在水凝胶保持器中印刷例如含有胶原和其他生物纤维的软组织。 然后通过熔化载体而不损坏细胞和结构来回收印花织物。 遵循这一原则,已经成功印刷了股骨,冠状动脉,血管和胚胎心脏的模型。 这些细胞组织对于给器官充氧是必需的,但尚未对人体进行测试,并且不允许器官如肝,肺或心脏完全血管化。

由于脉管系统领域的进步,现在可以创造微型器官。 例如,Organovo已经尝试印刷各种类型的复杂组织,如肺部和心肌片。 她设法制作了一块肾脏(1毫米厚,4毫米宽),在实验室外存活了5天。 他们还创造了一种重建的人体肝脏,可以保持40天的功能。 这种肝脏样本(3mm 2 x 0.5 mm厚)能够产生酶,蛋白质和胆固醇。这通过可能发生的交换而增加器官的寿命。 同样,中国研究人员开发的肾脏寿命目前限制在4个月。

“我们需要继续研究并收集更多信息,但组织表现得像肝脏这样的事实表明,当它开始用药物测试时,它会继续表现出来.Oganovo首席执行官Keith Murphy说.Organovo公司最近商业化的肝脏组织至少可以保留42天。这些器官样本用于医学研究。但到目前为止,这些部分还没有与生物体整合。

2016年10月,哈佛研究人员利用集成传感器生物印刷了世界上第一个片上心脏。 该装置是微生理系统,模仿人体组织的行为。 这种完成是最复杂的片上器官,包括与该团队生产的肺,语言和片上肠相比。 这种生物印刷的器官芯片应用的开发可以减少医学研究对动物试验的依赖性。

其他机构
英国剑桥大学的研究人员宣布,他们有能力通过生物打印机重建大鼠视网膜中的神经细胞。 该打印机能够将来自大鼠干细胞的神经节细胞盒和神经胶质细胞盒相关联。 这种移植使动物能够恢复大部分视力,同时消除排斥风险。 2013年4月,普林斯顿大学的科学家给人一种仿生耳的印象:它将有机细胞和纳米粒子结合在一起,形成一个软骨天线。 由此产生的耳朵可以听到人类耳朵听不到的无线电频率。

哥伦比亚大学的科学家们正在研究生物印刷牙齿和关节的创造。 例如,该团队植入了一个由印在大鼠颌骨上的3D结构制成的切牙。 在两个月内,植入物允许生长支撑新形成的牙齿和骨骼的韧带。 研究小组还在兔子身上植入生物印刷的髋骨,几周后开始用新的关节行走。

挑战
虽然在可印刷器官的生产方面取得了突破,但临床实施,特别是复杂器官的临床实施,需要进一步的研究和开发。 生物印刷所需的细胞增殖在缺乏标记和天然生物过程的人工和受控环境中进行。 缺乏这些性质通常会抑制适当形态和细胞分化的发展。 当存在时,这些条件将允许印刷的器官更精确地模拟体内条件。并且采用与生物生长相反的结构和适当的功能,所述生物生长被设想为由细胞形成的简单支架34.一些技术挑战是解决包括:

血管形成:虽然有可能产生像皮肤35这样的基本细胞组织,但是不可能产生复杂的器官。 实际上,科学家们不能像毛细血管一样重建血管,因为它们长而薄,管状,打印机的准确性太低。 因此,任何器官的印象都是不可能的,因为细胞不会被氧气和葡萄糖喂养并且会很快死亡。 另外,迄今为止印刷的细胞皮肤组织未血管化,因此不适于移植。 细胞组织一旦厚度超过400微米就需要血管化。
神经系统:神经系统呈现出极大的复杂性。 没有神经,所产生的肌肉就无法操作,也无法移植。
多能细胞:生物印刷需要大量的多能细胞。
印刷细胞的存活时间:目前,印花织物不会长寿,因为它们不在自然环境中。 例如,Organovo公司设法印刷了一个4毫米×1毫米的微型肾脏,但它只活了5天。
价格:高端功能性生物打印机的成本仍然非常昂贵,因此很难被小型研究实验室或医院收购。 实际上,生物打印机的成本高达数十万欧元。
器官的复杂组织:例如,肾脏由一百万个肾单位组成,提供血液过滤和尿液产生。 每个肾单位由多个亚单位组成,例如肾小球本身由四种类型的细胞组成……这种组织逐层打印非常复杂。
严重程度:即使是最着名的印刷生物技术,科学家也不得不因重力而逐层印刷组织,这使得大型物体的形成大大复杂化,在自身重量下会坍塌并使分子结构变形。
科学知识:这可能是复杂器官发育和印刷的最大障碍。 在诸如神经系统或身体的形态发生等几个领域中,人们感觉缺乏对人体的全球知识。

最近的发展

血管化
2017年4月,加利福尼亚大学的一个研究小组成功地使用所谓的“微观连续光学生物印模”(μCOB)生物印刷方法生产具有复杂三维微结构的血管化组织。 印刷组织的体内植入证明了预血管化组织中内皮网络的存活和进行性形成。

严重
由于重力,科学家被迫在连续的细胞层中印刷细胞器官和组织。 根据它们,如果例如通过磁场以非失重的伪状态打印器官,则可以正确地放置细胞并且不会变形。

弗拉基米尔米罗诺夫教授和他的研究小组已就国际空间站上的测试达成协议。

为了对抗这种引力现象,Adam Feinbergon教授的团队有想法将细胞沉积在水凝胶(水基凝胶状立方体)的立方体中。 如此沉积的细胞保持在水凝胶中的悬浮液中,这使它们有时间产生足够的细胞连接,使得所产生的器官不会变形。 凝胶在体温(37℃)下在水中熔化。 一旦建立连接,将水凝胶立方体浸入37℃的水中就足以恢复完整的成形器官。

复杂的组织
INSERM Bordeaux的研究团队由Fabien Guillemot领导,旨在重建功能性肾脏。 为此,他们决定不逐层打印,而是逐个打印[精确度]。 事实上,肾脏的复杂组织使得无法逐层打印,INSERM团队首先想要制造肾小球然后可以组装成肾单位,自己组装成肾功能。

多能细胞
2012年,日本研究员山中伸弥(Shinya Yamanaka)成功地从皮肤细胞等分化细胞中创造出功能性多能干细胞。事实上,经过7年对小鼠的研究和测试,日本研究人员发现,通过摄取编码多能干细胞非分化的基因并将其置于分化细胞的遗传组成中,最后这种基因变得多能。这一发现为他赢得了诺贝尔医学奖。结果,有可能产生对个体特异的多能干细胞培养物,甚至没有骨髓样品。

将这些重编程为干细胞的分化细胞命名为英语诱导的多能干细胞或法国诱导的多能干细胞的细胞的iPS。