В химии спектрофотометрия представляет собой количественное измерение отражательных или передаточных свойств материала в зависимости от длины волны. Это более специфично, чем общий термин электромагнитная спектроскопия в том, что спектрофотометрия касается видимого света, ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного излучения, но не охватывает спектроскопические методы с временным разрешением.

обзор
Спектрофотометрия — это инструмент, зависящий от количественного анализа молекул в зависимости от того, сколько света поглощается цветными соединениями. Спектрофотометрия использует фотометры, известные как спектрофотометры, которые могут измерять интенсивность светового пучка в зависимости от его цвета (длины волны). Важными особенностями спектрофотометров являются спектральная ширина полосы пропускания (диапазон цветов, которые он может передавать через образец), процент пробы-передачи, логарифмический диапазон поглощения образца, а иногда и процент измерения отражения.

Спектрофотометр обычно используется для измерения коэффициента пропускания или отражения растворов, прозрачных или непрозрачных твердых веществ, таких как полированное стекло или газы. Хотя многие биохимические вещества окрашены, как и в, они поглощают видимый свет и поэтому могут быть измерены колориметрическими процедурами, даже бесцветные биохимические вещества могут часто превращаться в окрашенные соединения, подходящие для хромогенных цветообразующих реакций, для получения соединений, подходящих для колориметрического анализа. Тем не менее, они также могут быть предназначены для измерения коэффициента диффузии на любом из перечисленных диапазонов освещенности, которые обычно покрывают приблизительно 200 нм — 2500 нм, используя различные средства управления и калибровки. В этих диапазонах света на машине требуются калибровки с использованием стандартов, которые различаются по типу в зависимости от длины волны фотометрического определения.

Примером эксперимента, в котором используется спектрофотометрия, является определение константы равновесия решения. Определенная химическая реакция в растворе может происходить в прямом и обратном направлениях, когда реагенты образуют продукты и продукты, разлагающиеся на реагенты. В какой-то момент эта химическая реакция достигнет точки равновесия, называемой точкой равновесия. Чтобы определить соответствующие концентрации реагентов и продуктов в этот момент, светопроницаемость раствора может быть испытана с использованием спектрофотометрии. Количество света, проходящего через раствор, указывает на концентрацию определенных химических веществ, которые не пропускают свет.

Поглощение света связано с взаимодействием света с электронным и колебательным модами молекул. Каждый тип молекулы имеет индивидуальный набор уровней энергии, связанных с составом его химических связей и ядер, и таким образом поглощает свет определенных длин волн или энергий, что приводит к уникальным спектральным свойствам. Это основано на его специфическом и отличном составе.

Использование спектрофотометров охватывает различные научные области, такие как физика, материаловедение, химия, биохимия и молекулярная биология. Они широко используются во многих отраслях промышленности, включая полупроводники, лазерное и оптическое производство, печать и судебно-медицинскую экспертизу, а также в лабораториях по изучению химических веществ. Спектрофотометрия часто используется для измерения активности ферментов, определения концентраций белка, определения ферментативных кинетических констант и измерений реакций связывания лиганда. В конечном счете, спектрофотометр способен определять, в зависимости от контроля или калибровки, какие вещества присутствуют в мишени и точно, сколько через расчеты наблюдаемых длин волн.

В астрономии термин спектрофотометрия относится к измерению спектра небесного объекта, в котором шкала потока спектра калибруется как функция длины волны, обычно по сравнению с наблюдением спектрофотометрической стандартной звезды, и корректируется для поглощения света земной атмосферой.

история
К 1940 году на рынке появилось несколько спектрофотометров, но ранние модели не могли работать в ультрафиолете. Арнольд О. Бекман разработал улучшенную версию в Национальной технической лаборатории компании, позже Beckman Instrument Company и, в конечном счете, Beckman Coulter. Были разработаны модели A, B и C (были созданы три единицы модели C), затем модель D, которая стала DU. Вся электроника содержалась в корпусе прибора, и у нее была новая водородная лампа с ультрафиолетовым континуумом и лучший монохроматор. Этот инструмент был создан с 1941 по 1976 год, по существу, с той же конструкцией; было продано более 30 000 экземпляров. Цена 1941 года составляла 723 доллара США (дополнительные принадлежности для ультрафиолетовых лучей были опцией за дополнительную плату). Лауреат Нобелевской премии по химии Брюс Меррифилд сказал, что это «вероятно, самый важный инструмент, когда-либо созданный для развития бионауки».

дизайн
Существует два основных класса устройств: однолучевое и двухлучевое. Двухлучевой спектрофотометр сравнивает интенсивность света между двумя световыми путями, один путь содержит контрольный образец, а другой — образец. Однолучевой спектрофотометр измеряет относительную интенсивность света пучка до и после установки тестового образца. Хотя сравнительные измерения из двухлучевых приборов проще и стабильнее, однолучевые приборы могут иметь больший динамический диапазон и оптически проще и компактнее. Кроме того, некоторые специализированные инструменты, такие как спектрофотометры, встроенные в микроскопы или телескопы, являются однолучевыми инструментами из-за практичности.

Исторически спектрофотометры используют монохроматор, содержащий дифракционную решетку для получения аналитического спектра. Решетка может быть подвижной или фиксированной. Если используется один детектор, такой как фотоумножитель или фотодиод, решетку можно сканировать поэтапно, чтобы детектор мог измерять интенсивность света на каждой длине волны (что будет соответствовать каждому «шагу»). Также могут использоваться массивы детекторов, такие как устройства с зарядовой связью (ПЗС) или фотодиодные массивы (PDA). В таких системах решетка фиксирована, а интенсивность каждой длины волны света измеряется другим детектором в массиве. Кроме того, большинство современных спектрофотометров средней инфракрасной области используют метод преобразования Фурье для получения спектральной информации. Этот метод называется инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье.

При проведении измерений передачи спектрофотометр количественно сравнивает долю света, которая проходит через эталонный раствор и тестовый раствор, затем электронным образом сравнивает интенсивности двух сигналов и вычисляет процент передачи образца по сравнению с эталонным стандартом. Для измерений отражательной способности спектрофотометр количественно сравнивает долю света, которая отражается от эталонного и тестового образцов. Свет от источника лампы пропускается через монохроматор, который дифрагирует свет до «радуги» длин волн через вращающуюся призму и выводит узкие полосы пропускания этого дифрагированного спектра через механическую щель на выходной стороне монохроматора. Эти полосы пропускания передаются через тестовый образец. Тогда плотность потока фотонов (ватт на метр квадрата обычно) передаваемого или отраженного света измеряется с помощью фотодиода, устройства с зарядовой связью или другого светочувствительного датчика. Затем коэффициент пропускания или коэффициент отражения для каждой длины волны тестируемого образца сравнивают с значениями передачи или отражения от эталонного образца. Большинство приборов будут применять логарифмическую функцию к коэффициенту линейного коэффициента пропускания для расчета «впитывающей способности» образца, величина которого пропорциональна «концентрации» измеряемого химического вещества.

Короче говоря, последовательность событий в современном спектрофотометре выглядит следующим образом:

Источник света сияет в монохроматоре, дифрагируется в радугу и разбивается на два луча. Затем он сканируется через образец и эталонные решения.
Фракции падающих длин волн передаются через образец или ссылку на него или отражаются.
Полученный свет попадает на фотоприемное устройство, которое сравнивает относительную интенсивность двух лучей.
Электронные схемы преобразуют относительные токи в проценты линейной передачи и / или значения поглощения / концентрации.
Многие старые спектрофотометры должны быть откалиброваны с помощью процедуры, известной как «обнуление», чтобы сбалансировать нулевой ток двух лучей на детекторе. Передача эталонного вещества устанавливается как базовое (исходное) значение, поэтому передача всех других веществ регистрируется относительно исходного «обнуленного» вещества. Затем спектрофотометр преобразует передаточное отношение в «впитываемость», концентрацию конкретных компонентов испытуемого образца относительно исходного вещества.

Приложения в биохимии
Спектрофотометрия — важный метод, используемый во многих биохимических экспериментах, которые включают выделение ДНК, РНК и белка, кинетику ферментов и биохимические анализы. Краткое объяснение процедуры спектрофотометрии включает в себя сравнение впитывающей способности чистого образца, который не содержит окрашенного соединения к образцу, который содержит окрашенное соединение. Эта окраска может быть выполнена либо красителем, как краситель Coomasie Brilliant Blue G-250, измеренным при 595 нм, или ферментативной реакцией, наблюдаемой между β-галактозидазой и ONPG (поворачивается образец желтого цвета), измеренным при 420 нм. Спектрофотометр используется для измерения цветных соединений в видимой области света (от 350 до 800 нм), поэтому его можно использовать для поиска дополнительной информации о исследуемом веществе. В биохимических экспериментах выбирается химическое и / или физическое свойство, и применяемая процедура специфична для этого свойства, чтобы получить больше информации о пробе, например количество, чистоту, активность фермента и т. Д. Можно использовать спектрофотометрию для ряда методов, таких как определение оптимальной длины волны поглощения образцов, определение оптимального рН для поглощения образцов, определение концентраций неизвестных образцов и определение pKa различных образцов. Спектрофотометрия также является полезным процессом для очистки белка и может также использоваться в качестве способа создания оптических анализов соединения. Спектрофотометрические данные также можно использовать в сочетании с уравнением Беер-Ламберта, A = -log10T = εcl = OD, чтобы определить различные зависимости между коэффициентом пропускания и концентрацией, а также поглощением и концентрацией. Поскольку спектрофотометр измеряет длину волны соединения по его цвету, может быть добавлено связующее краситель, чтобы оно могло подвергаться изменению цвета и измеряться. Можно узнать концентрации двухкомпонентной смеси, используя спектры поглощения стандартных растворов каждого компонента. Для этого необходимо знать коэффициент экстинкции этой смеси при двух длинах волн и коэффициенты экстинкции растворов, которые содержат известные веса двух компонентов. Спектрофотометры были разработаны и усовершенствованы в течение десятилетий и широко используются среди химиков. Кроме того, Спектрофотометры специализируются для измерения значений поглощения УФ или видимой световой волны. Он считается высокоточным инструментом, который также очень чувствителен и поэтому чрезвычайно точен, особенно при определении изменения цвета. Этот метод также удобен для использования в лабораторных экспериментах, потому что он является недорогим и относительно простым процессом.

УФ-видимая спектрофотометрия
Большинство спектрофотометров используются в УФ и видимых областях спектра, а некоторые из этих приборов также работают и в ближней инфракрасной области. Концентрация белка может быть оценена путем измерения OD на 280 нм из-за присутствия триптофана, тирозина и фенилаланина. Этот метод не очень точен, поскольку состав белков сильно варьирует, и белки, у которых ни одна из этих аминокислот не имеет максимального поглощения при 280 нм. Загрязнение нуклеиновой кислоты также может мешать. Для этого метода требуется спектрофотометр, способный измерять в УФ области кварцевыми кюветами.

Ультрафиолетовая видимая (УФ-видимость) спектроскопия включает уровни энергии, которые возбуждают электронные переходы. Поглощение ультрафиолетового света возбуждает молекулы, находящиеся в основном состоянии, в их возбужденные состояния

Видимая область 400-700 нм спектрофотометрия широко используется в науке о колориметрии. Известный факт, что он лучше всего работает в диапазоне 0,2-0,8 производителей чернил OD, полиграфических компаний, поставщиков текстиля и многих других, нуждаются в данных, предоставляемых посредством колориметрии. Они считывают показания в области каждых 5-20 нанометров вдоль видимой области и производят кривую спектрального отражения или поток данных для альтернативных презентаций. Эти кривые можно использовать для проверки новой партии красителя, чтобы проверить, соответствует ли она спецификациям, например стандартам ISO-печати.

Традиционные спектрофотометры видимой области не могут обнаружить, имеет ли краситель или базовый материал флуоресценцию. Это может затруднить управление проблемами цвета, если, например, одна или несколько печатающих чернил являются флуоресцентными. Когда краситель содержит флуоресценцию, используется двухспектральный флуоресцентный спектрофотометр. Существуют две основные установки для спектрофотометров зрительного спектра, d / 8 (сферическая) и 0/45. Названия связаны с геометрией источника света, наблюдателя и внутренней части измерительной камеры. Ученые используют этот инструмент для измерения количества соединений в образце. Если соединение будет более концентрированным, свет будет поглощаться образцом; в малых пределах соблюдается закон Пира-Ламберта, а поглощение между образцами изменяется линейно. В случае типографских измерений обычно используются две альтернативные настройки — без / с фильтром uv, чтобы лучше контролировать эффект отбеливателей uv в бумажной массе.

Образцы обычно готовят в кюветах; в зависимости от интересующей области они могут быть изготовлены из стекла, пластика (представляющая интерес область видимого спектра) или кварца (интересующая область дальнего ультрафиолетового спектра).

Приложения
Оценка концентрации растворенного органического углерода
Удельная поглощаемость ультрафиолетом для метрики ароматичности
Испытание Биала на концентрацию пентоз
Экспериментальное применение
Как описано в разделе приложений, спектрофотометрия может использоваться как в качественном, так и в количественном анализе ДНК, РНК и белков. Качественный анализ может быть использован, и спектрофотометры используются для регистрации спектров соединений путем сканирования областей с широкой длиной волны для определения оптических свойств (интенсивности цвета) соединения на каждой длине волны. Один эксперимент, который может продемонстрировать различные применения, которые может иметь видимая спектрофотометрия, заключается в отделении β-галактозидазы от смеси различных белков. Во многом спектрофотометрия лучше всего использовать для количественного определения количества очищения, которое ваш образец прошел по отношению к общей концентрации белка. Путем аффинной хроматографии вы можете выделить B-Galactosidase, и это можно проверить, отвечая собранным образцам с ONPG и определяя, станет ли образец желтым. После этого испытания образца при 420 нм для специфического взаимодействия с ONPG и при 595 для анализа Брэдфорда количество очистки можно оценить количественно. В дополнение к этой спектрофотометрии можно использовать в тандеме с другими методами, такими как электрофорез SDS-страницы, для очистки и выделения различных образцов белка.

ИК-спектрофотометрия
Спектрофотометры, предназначенные для инфракрасной области, весьма различны из-за технических требований измерения в этом регионе. Одним из основных факторов является тип фотодатчиков, которые доступны для разных спектральных областей, но инфракрасные измерения также сложны, потому что практически все излучает инфракрасный свет как тепловое излучение, особенно на длинах волн около 5 мкм.

Еще одно осложнение состоит в том, что довольно много материалов, таких как стекло и пластик, поглощают инфракрасный свет, что делает его несовместимым в качестве оптической среды. Идеальными оптическими материалами являются соли, которые не поглощают сильно. Образцы для ИК-спектрофотометрии могут быть размыты между двумя дисками бромида калия или измельчены бромидом калия и прессованы в гранулу. Там, где необходимо измерять водные растворы, для создания клетки используют нерастворимый хлорид серебра.

спектрорадиометры
Спектрарадиометры, которые работают почти как спектрофотометры видимой области, предназначены для измерения спектральной плотности источников света. Заявки могут включать в себя оценку и категоризацию освещения для продаж производителем или для того, чтобы клиенты подтвердили, что лампа, которую они решили приобрести, соответствует их спецификациям. Компоненты:

Источник света светит на образец или через него.
Образец передает или отражает свет.
Детектор обнаруживает, сколько света было отражено или передано через образец.
Затем детектор преобразует количество света, передаваемого или отраженного в число.