In chimica, la spettrofotometria è la misura quantitativa delle proprietà di riflessione o trasmissione di un materiale in funzione della lunghezza d’onda. È più specifico del termine generale spettroscopia elettromagnetica in quanto la spettrofotometria riguarda la luce visibile, il vicino-ultravioletto e il vicino-infrarosso, ma non copre le tecniche spettroscopiche risolte nel tempo.

Panoramica
La spettrofotometria è uno strumento che dipende dall’analisi quantitativa delle molecole a seconda di quanta luce viene assorbita dai composti colorati. La spettrofotometria utilizza fotometri, noti come spettrofotometri, che possono misurare l’intensità di un raggio di luce in funzione del suo colore (lunghezza d’onda). Le caratteristiche importanti degli spettrofotometri sono la larghezza di banda spettrale (la gamma di colori che può trasmettere attraverso il campione di prova), la percentuale di trasmissione del campione, la gamma logaritmica di assorbimento del campione e talvolta una percentuale di misurazione della riflettanza.

Uno spettrofotometro viene comunemente usato per misurare la trasmittanza o la riflettanza di soluzioni, solidi trasparenti o opachi, come vetro lucidato o gas. Sebbene molte sostanze biochimiche siano colorate, come in, assorbono la luce visibile e quindi possono essere misurate mediante procedure colorimetriche, anche le sostanze biochimiche incolori possono spesso essere convertite in composti colorati adatti per reazioni cromogene cromogene per produrre composti adatti all’analisi colorimetrica. Tuttavia, possono anche essere progettati per misurare la diffusività su uno qualsiasi degli intervalli di luce elencati che di solito coprono circa 200 nm – 2500 nm utilizzando diversi controlli e calibrazioni. All’interno di questi intervalli di luce, sono necessarie calibrazioni sulla macchina utilizzando standard che variano in base alla lunghezza d’onda della determinazione fotometrica.

Un esempio di un esperimento in cui viene utilizzata la spettrofotometria è la determinazione della costante di equilibrio di una soluzione. Una certa reazione chimica all’interno di una soluzione può avvenire in direzione avanti e retromarcia, dove i reagenti formano prodotti e prodotti che si trasformano in reagenti. Ad un certo punto, questa reazione chimica raggiungerà un punto di equilibrio chiamato punto di equilibrio. Al fine di determinare le rispettive concentrazioni di reagenti e prodotti a questo punto, è possibile testare la trasmissione luminosa della soluzione mediante spettrofotometria. La quantità di luce che attraversa la soluzione è indicativa della concentrazione di alcune sostanze chimiche che non permettono alla luce di passare.

L’assorbimento della luce è dovuto all’interazione della luce con i modi elettronici e vibrazionali delle molecole. Ogni tipo di molecola ha un insieme individuale di livelli di energia associati al trucco dei suoi legami chimici e dei suoi nuclei, e quindi assorbirà la luce di specifiche lunghezze d’onda, o energie, risultando in proprietà spettrali uniche. Questo è basato sul suo trucco specifico e distinto.

L’uso di spettrofotometri abbraccia diversi campi scientifici, come la fisica, la scienza dei materiali, la chimica, la biochimica e la biologia molecolare. Sono ampiamente utilizzati in molti settori, tra cui semiconduttori, produzione laser e ottica, stampa e analisi forense, nonché in laboratori per lo studio di sostanze chimiche. La spettrofotometria viene spesso utilizzata nelle misurazioni delle attività enzimatiche, nelle determinazioni delle concentrazioni di proteine, nelle determinazioni delle costanti cinetiche enzimatiche e nelle misurazioni delle reazioni di legame del ligando. In definitiva, uno spettrofotometro è in grado di determinare, a seconda del controllo o della calibrazione, quali sostanze sono presenti in un bersaglio e esattamente quanto attraverso i calcoli delle lunghezze d’onda osservate.

In astronomia, il termine spettrofotometria si riferisce alla misurazione dello spettro di un oggetto celeste in cui la scala di flusso dello spettro è calibrata in funzione della lunghezza d’onda, di solito rispetto ad un’osservazione di una stella standard spettrofotometrica, e corretta per l’assorbimento di luce dall’atmosfera terrestre.

Storia
Nel 1940 sul mercato erano disponibili diversi spettrofotometri, ma i primi modelli non potevano funzionare nell’ultravioletto. Arnold O. Beckman ha sviluppato una versione migliorata presso la National Technical Laboratories Company, in seguito la Beckman Instrument Company e, infine, Beckman Coulter. I modelli A, B e C sono stati sviluppati (sono state prodotte tre unità del modello C), quindi il modello D, che è diventato DU. Tutta l’elettronica era contenuta nella custodia dello strumento e aveva una nuova lampada a idrogeno con un continuo ultravioletto e un monocromatore migliore. Questo strumento fu prodotto dal 1941 al 1976 con essenzialmente lo stesso design; oltre 30.000 sono stati venduti. Il prezzo del 1941 era di US $ 723 (gli accessori anti-UV erano un’opzione ad un costo aggiuntivo). Il premio Nobel per la chimica Bruce Merrifield ha detto che è “probabilmente lo strumento più importante mai sviluppato per il progresso della bioscienza”.

Design
Esistono due principali classi di dispositivi: singolo raggio e doppio raggio. Uno spettrofotometro a doppio raggio confronta l’intensità della luce tra due percorsi luminosi, un percorso contenente un campione di riferimento e l’altro il campione di prova. Uno spettrofotometro a raggio singolo misura l’intensità della luce relativa del fascio prima e dopo l’inserimento di un campione di prova. Sebbene le misure di confronto degli strumenti a doppio raggio siano più semplici e stabili, gli strumenti a raggio singolo possono avere una gamma dinamica più ampia e sono più semplici e compatti. Inoltre, alcuni strumenti specializzati, come gli spettrofotometri costruiti su microscopi o telescopi, sono strumenti a raggio singolo a causa della praticità.

Storicamente, gli spettrofotometri usano un monocromatore contenente un reticolo di diffrazione per produrre lo spettro analitico. La griglia può essere mobile o fissa. Se viene utilizzato un singolo rivelatore, come un tubo fotomoltiplicatore o un fotodiodo, il reticolo può essere scansionato gradualmente in modo che il rilevatore possa misurare l’intensità della luce a ciascuna lunghezza d’onda (che corrisponderà a ciascun “gradino”). Possono anche essere utilizzati array di rivelatori, come dispositivi con accoppiamento di carica (CCD) o array di fotodiodi (PDA). In tali sistemi, il reticolo è fisso e l’intensità di ciascuna lunghezza d’onda della luce viene misurata da un diverso rivelatore nell’array. Inoltre, i più moderni spettrofotometri a medio infrarosso utilizzano una tecnica di trasformazione di Fourier per acquisire le informazioni spettrali. Questa tecnica è chiamata spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier.

Quando si effettuano misurazioni di trasmissione, lo spettrofotometro confronta quantitativamente la frazione di luce che passa attraverso una soluzione di riferimento e una soluzione di test, quindi confronta elettronicamente le intensità dei due segnali e calcola la percentuale di trasmissione del campione rispetto allo standard di riferimento. Per le misure di riflettanza, lo spettrofotometro confronta quantitativamente la frazione di luce che si riflette dai campioni di riferimento e di prova. La luce della lampada sorgente viene fatta passare attraverso un monocromatore, che diffrange la luce in un “arcobaleno” di lunghezze d’onda attraverso un prisma rotante ed emette ampiezze di banda strette di questo spettro diffratto attraverso una fenditura meccanica sul lato di uscita del monocromatore. Queste larghezze di banda vengono trasmesse attraverso il campione di prova. Quindi la densità del flusso di fotoni (watt per metro quadrato in genere) della luce trasmessa o riflessa viene misurata con un fotodiodo, un dispositivo con accoppiamento di carica o un altro sensore di luce. Il valore di trasmittanza o riflettanza per ciascuna lunghezza d’onda del campione di prova viene quindi confrontato con i valori di trasmissione o di riflettanza del campione di riferimento. La maggior parte degli strumenti applicherà una funzione logaritmica al rapporto di trasmittanza lineare per calcolare la “assorbenza” del campione, un valore che è proporzionale alla “concentrazione” della sostanza chimica misurata.

In breve, la sequenza di eventi in uno spettrofotometro moderno è la seguente:

La sorgente di luce viene riflessa in un monocromatore, diffratta in un arcobaleno e divisa in due fasci. Viene quindi scansionato attraverso il campione e le soluzioni di riferimento.
Le frazioni delle lunghezze d’onda incidenti vengono trasmesse attraverso o riflesse dal campione e dal riferimento.
La luce risultante colpisce il dispositivo fotorivelatore, che confronta l’intensità relativa dei due fasci.
I circuiti elettronici convertono le correnti relative in percentuali di trasmissione lineare e / o valori di assorbanza / concentrazione.
Molti spettrofotometri più vecchi devono essere calibrati mediante una procedura nota come “azzeramento”, per bilanciare l’uscita di corrente nulla dei due fasci sul rivelatore. La trasmissione di una sostanza di riferimento viene impostata come valore di riferimento (datum), pertanto la trasmissione di tutte le altre sostanze viene registrata rispetto alla sostanza iniziale “azzerata”. Lo spettrofotometro converte quindi il rapporto di trasmissione in “assorbenza”, la concentrazione di componenti specifici del campione di prova rispetto alla sostanza iniziale.

Applicazioni in biochimica
La spettrofotometria è una tecnica importante utilizzata in molti esperimenti biochimici che riguardano l’isolamento di DNA, RNA e proteine, la cinetica enzimatica e le analisi biochimiche. Una breve spiegazione della procedura di spettrofotometria include il confronto tra l’assorbenza di un campione bianco che non contiene un composto colorato in un campione che contiene un composto colorato. Questa colorazione può essere ottenuta con un colorante come il colorante Coomasie Brilliant Blue G-250 misurato a 595 nm o con una reazione enzimatica come si vede tra β-galattosidasi e ONPG (spira campione giallo) misurato a 420 nm. Lo spettrofotometro viene utilizzato per misurare i composti colorati nella regione visibile della luce (tra 350 nm e 800 nm), quindi può essere utilizzato per trovare maggiori informazioni sulla sostanza studiata. Negli esperimenti biochimici viene scelta una proprietà chimica e / o fisica e la procedura utilizzata è specifica per quella proprietà al fine di ricavare maggiori informazioni sul campione, come la quantità, la purezza, l’attività enzimatica, ecc. La spettrofotometria può essere utilizzata per un numero di tecniche come determinare l’assorbanza di lunghezza d’onda ottimale dei campioni, determinare il pH ottimale per l’assorbanza dei campioni, determinare le concentrazioni di campioni sconosciuti e determinare il pKa di vari campioni. La spettrofotometria è anche un utile processo per la purificazione delle proteine ​​e può anche essere usata come metodo per creare analisi ottiche di un composto. I dati spettrofotometrici possono anche essere usati in congiunzione con l’equazione di Beer-Lambert, A = -log10T = εcl = OD, al fine di determinare varie relazioni tra trasmittanza e concentrazione, assorbanza e concentrazione. Poiché uno spettrofotometro misura la lunghezza d’onda di un composto attraverso il suo colore, può essere aggiunta una sostanza legante colorante in modo che possa subire un cambiamento di colore e essere misurata. È possibile conoscere le concentrazioni di una miscela bicomponente utilizzando gli spettri di assorbimento delle soluzioni standard di ciascun componente. Per fare ciò, è necessario conoscere il coefficiente di estinzione di questa miscela a due lunghezze d’onda e i coefficienti di estinzione delle soluzioni che contengono i pesi noti dei due componenti. Gli spettrofotometri sono stati sviluppati e migliorati per decenni e sono stati ampiamente usati dai chimici. Inoltre, gli spettrofotometri sono specializzati per misurare i valori di assorbanza della lunghezza d’onda della luce UV o visibile. È considerato uno strumento estremamente preciso, anche molto sensibile e quindi estremamente preciso, soprattutto per determinare il cambio di colore. Questo metodo è anche conveniente per l’uso in esperimenti di laboratorio perché è un processo poco costoso e relativamente semplice.

Spettrofotometria UV-visibile
La maggior parte degli spettrofotometri vengono utilizzati nelle regioni UV e visibili dello spettro e alcuni di questi strumenti operano anche nella regione del vicino infrarosso. La concentrazione di una proteina può essere stimata misurando la OD a 280 nm a causa della presenza di triptofano, tirosina e fenilalanina. Questo metodo non è molto accurato poiché la composizione delle proteine ​​varia notevolmente e le proteine ​​con nessuno di questi aminoacidi non hanno il massimo assorbimento a 280 nm. Anche la contaminazione degli acidi nucleici può interferire. Questo metodo richiede uno spettrofotometro in grado di misurare nella regione UV con cuvette al quarzo.

La spettroscopia ultravioletta-visibile (UV-vis) coinvolge livelli di energia che eccitano le transizioni elettroniche. L’assorbimento della luce UV-vis eccita le molecole che si trovano negli stati-base ai loro stati eccitati

La spettrofotometria visibile della regione 400-700 nm è ampiamente utilizzata nella scienza della colorimetria. È noto che opera al meglio nell’intervallo 0,2-0,8 O.D. I produttori di inchiostri, le tipografie, i venditori di tessuti e molti altri hanno bisogno dei dati forniti attraverso la colorimetria. Prendono letture nella regione di ogni 5-20 nanometri lungo la regione visibile e producono una curva di riflettanza spettrale o un flusso di dati per presentazioni alternative. Queste curve possono essere utilizzate per testare un nuovo lotto di colorante per verificare se fa corrispondere le specifiche, ad es. Agli standard di stampa ISO.

Gli spettrofotometri della regione visibile tradizionale non sono in grado di rilevare se un colorante o il materiale di base ha fluorescenza. Ciò può rendere difficile la gestione dei problemi relativi ai colori se, ad esempio, uno o più inchiostri di stampa sono fluorescenti. Quando un colorante contiene fluorescenza, viene utilizzato uno spettrofotometro fluorescente bi-spettrale. Esistono due configurazioni principali per gli spettrofotometri dello spettro visivo, d / 8 (sferica) e 0/45. I nomi sono dovuti alla geometria della sorgente luminosa, dell’osservatore e dell’interno della camera di misurazione. Gli scienziati usano questo strumento per misurare la quantità di composti in un campione. Se il composto è più concentrato, più luce sarà assorbita dal campione; entro piccole distanze, la legge di Beer-Lambert regge e l’assorbanza tra i campioni varia linearmente con la concentrazione. Nel caso delle misure di stampa vengono comunemente utilizzate due impostazioni alternative, senza / con filtro UV, per controllare meglio l’effetto dei brillantanti UV all’interno della carta.

I campioni vengono solitamente preparati in cuvette; a seconda della regione di interesse, possono essere costruite in vetro, plastica (regione di interesse dello spettro visibile) o quarzo (regione di interesse dello spettro UV lontano).

applicazioni
Stima della concentrazione di carbonio organico disciolto
Assorbanza ultravioletta specifica per metrica di aromaticità
Test di Bial per la concentrazione di pentosi
Applicazione sperimentale
Come descritto nella sezione delle applicazioni, la spettrofotometria può essere utilizzata sia in analisi qualitativa che quantitativa di DNA, RNA e proteine. L’analisi qualitativa può essere utilizzata e gli spettrofotometri sono utilizzati per registrare spettri di composti mediante la scansione di ampie regioni di lunghezza d’onda per determinare le proprietà di assorbanza (l’intensità del colore) del composto a ciascuna lunghezza d’onda. Un esperimento in grado di dimostrare i vari usi che può avere la spettrofotometria visibile è la separazione della β-galattosidasi da una miscela di varie proteine. In gran parte, la spettrofotometria è meglio utilizzata per aiutare a quantificare la quantità di purificazione che il campione ha subito rispetto alla concentrazione totale di proteine. Eseguendo una cromatografia di affinità, è possibile isolare la B-galattosidasi e questo può essere testato facendo reagire i campioni raccolti con ONPG e determinando se il campione diventa giallo. Seguendo questo test il campione a 420 nm per l’interazione specifica con ONPG e al 595 per un saggio Bradford la quantità di purificazione può essere valutata quantitativamente. Oltre a questa spettrofotometria può essere utilizzato in tandem con altre tecniche come l’elettroforesi su SDS-Page per purificare e isolare vari campioni di proteine.

Spettrofotometria IR
Gli spettrofotometri progettati per la regione dell’infrarosso sono molto diversi a causa dei requisiti tecnici di misurazione in quella regione. Uno dei fattori principali è il tipo di fotosensori disponibili per diverse regioni spettrali, ma la misurazione a infrarossi è anche impegnativa perché praticamente tutto emette luce IR come radiazione termica, specialmente a lunghezze d’onda superiori a circa 5 μm.

Un’altra complicazione è che alcuni materiali come il vetro e la plastica assorbono la luce infrarossa, rendendola incompatibile come mezzo ottico. I materiali ottici ideali sono i sali, che non assorbono fortemente. I campioni per la spettrofotometria IR possono essere spalmati tra due dischi di bromuro di potassio o macinati con bromuro di potassio e pressati in un pellet. Laddove si debbano misurare soluzioni acquose, per la costruzione della cella viene utilizzato il cloruro di argento insolubile.

Spettroradiometri
Gli spettroradiometri, che funzionano quasi come gli spettrofotometri della regione visibile, sono progettati per misurare la densità spettrale degli illuminanti. Le applicazioni possono includere la valutazione e la categorizzazione dell’illuminazione per le vendite da parte del produttore, o per i clienti per confermare che la lampada che hanno deciso di acquistare rientra nelle loro specifiche. componenti:

La sorgente luminosa si illumina o attraversa il campione.
Il campione trasmette o riflette la luce.
Il rilevatore rileva la quantità di luce riflessa o trasmessa attraverso il campione.
Il rilevatore converte quindi la quantità di luce che il campione ha trasmesso o riflesso in un numero.