En chimie, la spectrophotométrie est la mesure quantitative des propriétés de réflexion ou de transmission d’un matériau en fonction de la longueur d’onde. Il est plus spécifique que le terme général de spectroscopie électromagnétique en ce sens que la spectrophotométrie traite de la lumière visible, du proche ultraviolet et du proche infrarouge, mais ne couvre pas les techniques spectroscopiques à résolution temporelle.

Aperçu
La spectrophotométrie est un outil qui repose sur l’analyse quantitative des molécules en fonction de la quantité de lumière absorbée par les composés colorés. La spectrophotométrie utilise des photomètres, appelés spectrophotomètres, capables de mesurer l’intensité d’un faisceau lumineux en fonction de sa couleur (longueur d’onde). Les caractéristiques importantes des spectrophotomètres sont la largeur de bande spectrale (la gamme de couleurs qu’elle peut transmettre à travers l’échantillon), le pourcentage de transmission d’échantillon, la plage logarithmique d’absorption d’échantillon et parfois un pourcentage de mesure de réflectance.

Un spectrophotomètre est couramment utilisé pour la mesure de la transmittance ou de la réflectance de solutions, de solides transparents ou opaques, tels que du verre poli, ou des gaz. Bien que de nombreux produits biochimiques soient colorés, absorbent la lumière visible et peuvent donc être mesurés par des méthodes colorimétriques, même les produits biochimiques incolores peuvent souvent être convertis en composés colorés convenant aux réactions colorantes chromogènes pour produire des composés convenant à l’analyse colorimétrique. Cependant, ils peuvent également être conçus pour mesurer la diffusivité sur l’une quelconque des plages de lumière énumérées qui couvrent habituellement environ 200 nm – 2500 nm en utilisant différents contrôles et étalonnages. À l’intérieur de ces plages de lumière, des étalonnages sont nécessaires sur la machine en utilisant des normes dont le type varie en fonction de la longueur d’onde de la détermination photométrique.

Un exemple d’expérience dans laquelle la spectrophotométrie est utilisée est la détermination de la constante d’équilibre d’une solution. Une certaine réaction chimique au sein d’une solution peut se produire dans une direction directe et inverse, où les réactifs forment des produits et des produits qui se décomposent en réactifs. À un certain point, cette réaction chimique atteindra un point d’équilibre appelé point d’équilibre. Afin de déterminer les concentrations respectives de réactifs et de produits à ce stade, le facteur de transmission de la lumière de la solution peut être testé en utilisant la spectrophotométrie. La quantité de lumière qui traverse la solution indique la concentration de certains produits chimiques qui ne laissent pas passer la lumière.

L’absorption de la lumière est due à l’interaction de la lumière avec les modes électroniques et vibrationnels des molécules. Chaque type de molécule possède un ensemble individuel de niveaux d’énergie associés à la constitution de ses liaisons chimiques et de ses noyaux, et absorbe ainsi la lumière de longueurs d’onde spécifiques, ou énergies, résultant en des propriétés spectrales uniques. Ceci est basé sur sa composition spécifique et distincte.

L’utilisation de spectrophotomètres couvre divers domaines scientifiques, tels que la physique, la science des matériaux, la chimie, la biochimie et la biologie moléculaire. Ils sont largement utilisés dans de nombreuses industries, y compris les semi-conducteurs, la fabrication laser et optique, l’impression et l’examen médico-légal, ainsi que dans les laboratoires pour l’étude des substances chimiques. La spectrophotométrie est souvent utilisée pour mesurer les activités enzymatiques, déterminer les concentrations de protéines, déterminer les constantes cinétiques enzymatiques et mesurer les réactions de liaison au ligand. En fin de compte, un spectrophotomètre est capable de déterminer, en fonction du contrôle ou de l’étalonnage, quelles substances sont présentes dans une cible et exactement à travers les calculs des longueurs d’onde observées.

En astronomie, le terme spectrophotométrie désigne la mesure du spectre d’un objet céleste dans lequel l’échelle de flux du spectre est étalonnée en fonction de la longueur d’onde, généralement par comparaison avec une observation d’une étoile spectrophotométrique standard, et corrigée pour l’absorption de la lumière par l’atmosphère de la Terre.

Histoire
En 1940, plusieurs spectrophotomètres étaient disponibles sur le marché, mais les premiers modèles ne pouvaient pas fonctionner dans l’ultraviolet. Arnold O. Beckman a développé une version améliorée à la National Technical Laboratories Company, plus tard la Beckman Instrument Company et finalement Beckman Coulter. Les modèles A, B et C ont été développés (trois unités du modèle C ont été produites), puis le modèle D, qui est devenu DU. Toute l’électronique était contenue dans le boîtier de l’instrument, et il y avait une nouvelle lampe à hydrogène avec un continuum ultraviolet et un meilleur monochromateur. Cet instrument a été produit de 1941 à 1976 avec essentiellement le même design; plus de 30 000 ont été vendus. 1941 prix était US $ 723 (accessoires UV lointain étaient une option à un coût supplémentaire). Le lauréat du prix Nobel de chimie, Bruce Merrifield, a déclaré que c’était «probablement l’instrument le plus important jamais mis au point pour l’avancement des biosciences».

Conception
Il existe deux grandes catégories de dispositifs: à faisceau unique et à double faisceau. Un spectrophotomètre à double faisceau compare l’intensité de la lumière entre deux trajets de lumière, l’un contenant un échantillon de référence et l’autre l’échantillon d’essai. Un spectrophotomètre à faisceau unique mesure l’intensité lumineuse relative du faisceau avant et après l’insertion d’un échantillon d’essai. Bien que les mesures de comparaison des instruments à double faisceau soient plus faciles et plus stables, les instruments à faisceau unique peuvent avoir une plage dynamique plus large et sont plus simples et plus compacts du point de vue optique. De plus, certains instruments spécialisés, tels que les spectrophotomètres construits sur des microscopes ou des télescopes, sont des instruments à faisceau unique en raison de leur caractère pratique.

Historiquement, les spectrophotomètres utilisent un monochromateur contenant un réseau de diffraction pour produire le spectre analytique. Le réseau peut être mobile ou fixe. Si un seul détecteur, tel qu’un tube photomultiplicateur ou une photodiode, est utilisé, le réseau peut être balayé par étapes de sorte que le détecteur puisse mesurer l’intensité de la lumière à chaque longueur d’onde (qui correspondra à chaque « étape »). Des réseaux de détecteurs, tels que des dispositifs à couplage de charge (CCD) ou des réseaux de photodiodes (PDA), peuvent également être utilisés. Dans de tels systèmes, le réseau est fixe et l’intensité de chaque longueur d’onde de la lumière est mesurée par un détecteur différent dans le réseau. De plus, la plupart des spectrophotomètres à infrarouge moyen utilisent une technique de transformée de Fourier pour acquérir l’information spectrale. Cette technique est appelée spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.

Lors des mesures de transmission, le spectrophotomètre compare quantitativement la fraction de lumière traversant une solution de référence et une solution d’essai, puis compare électroniquement les intensités des deux signaux et calcule le pourcentage de transmission de l’échantillon par rapport à l’étalon de référence. Pour les mesures de réflectance, le spectrophotomètre compare quantitativement la fraction de lumière réfléchie provenant des échantillons de référence et d’essai. La lumière provenant de la lampe source est passée à travers un monochromateur, qui diffracte la lumière en un « arc-en-ciel » de longueurs d’onde à travers un prisme rotatif et émet des bandes passantes étroites de ce spectre diffracté par une fente mécanique du côté sortie du monochromateur. Ces bandes passantes sont transmises à travers l’échantillon de test. Ensuite, la densité de flux de photons (watts par mètre carré habituellement) de la lumière transmise ou réfléchie est mesurée avec une photodiode, un dispositif à couplage de charge ou un autre capteur de lumière. La valeur de transmittance ou de réflectance pour chaque longueur d’onde de l’échantillon d’essai est ensuite comparée aux valeurs de transmission ou de réflectance provenant de l’échantillon de référence. La plupart des instruments appliquent une fonction logarithmique au rapport de transmission linéaire pour calculer la «capacité d’absorption» de l’échantillon, valeur qui est proportionnelle à la «concentration» du produit chimique à mesurer.

En résumé, la séquence des événements dans un spectrophotomètre moderne est la suivante:

La source de lumière est éclairée dans un monochromateur, diffractée en arc-en-ciel et divisée en deux faisceaux. Il est ensuite scanné à travers l’échantillon et les solutions de référence.
Les fractions des longueurs d’onde incidentes sont transmises par l’échantillon et la référence, ou réfléchies par celui-ci.
La lumière résultante frappe le dispositif photodétecteur, qui compare l’intensité relative des deux faisceaux.
Les circuits électroniques convertissent les courants relatifs en pourcentages de transmission linéaire et / ou en valeurs d’absorbance / concentration.
De nombreux spectrophotomètres plus anciens doivent être étalonnés par une procédure connue sous le nom de « remise à zéro », pour équilibrer la sortie de courant nul des deux faisceaux au niveau du détecteur. La transmission d’une substance de référence est établie comme valeur de base (donnée), de sorte que la transmission de toutes les autres substances est enregistrée par rapport à la substance initiale «mise à zéro». Le spectrophotomètre convertit ensuite le rapport de transmission en «absorbance», la concentration de composants spécifiques de l’échantillon d’essai par rapport à la substance initiale.

Applications en biochimie
La spectrophotométrie est une technique importante utilisée dans de nombreuses expériences biochimiques impliquant l’ADN, l’ARN et l’isolement de protéines, la cinétique enzymatique et les analyses biochimiques. Une brève explication de la procédure de spectrophotométrie comprend la comparaison de l’absorbance d’un échantillon blanc qui ne contient pas de composé coloré à un échantillon qui contient un composé coloré. Cette coloration peut être réalisée soit par un colorant tel que le colorant bleu Coomasie Brilliant G-250 mesuré à 595 nm, soit par une réaction enzymatique observée entre la β-galactosidase et l’ONPG (tour d’échantillon jaune) mesurée à 420 nm. Le spectrophotomètre est utilisé pour mesurer les composés colorés dans la région visible de la lumière (entre 350 nm et 800 nm), il peut donc être utilisé pour trouver plus d’informations sur la substance à l’étude. Dans les expériences biochimiques, une propriété chimique et / ou physique est choisie et la procédure utilisée est spécifique à cette propriété pour obtenir plus d’informations sur l’échantillon, telles que la quantité, la pureté, l’activité enzymatique, etc. La spectrophotométrie peut être utilisée pour un certain nombre de techniques telles que la détermination de l’absorbance optimale des longueurs d’onde des échantillons, la détermination du pH optimal pour l’absorbance des échantillons, la détermination des concentrations d’échantillons inconnus et la détermination du pKa de divers échantillons. Spectrophotométrie est également un processus utile pour la purification des protéines et peut également être utilisé comme une méthode pour créer des dosages optiques d’un composé. Les données spectrophotométriques peuvent également être utilisées en conjonction avec l’équation de Beer-Lambert, A = -log10T = εcl = DO, afin de déterminer diverses relations entre la transmittance et la concentration, et l’absorbance et la concentration. Parce qu’un spectrophotomètre mesure la longueur d’onde d’un composé grâce à sa couleur, une substance liant le colorant peut être ajoutée de façon à pouvoir subir un changement de couleur et être mesurée. Il est possible de connaître les concentrations d’un mélange à deux composants en utilisant les spectres d’absorption des solutions étalons de chaque composant. Pour ce faire, il est nécessaire de connaître le coefficient d’extinction de ce mélange à deux longueurs d’onde et les coefficients d’extinction des solutions contenant les poids connus des deux composants. Les spectrophotomètres ont été développés et améliorés au fil des décennies et ont été largement utilisés par les chimistes. De plus, les spectrophotomètres sont spécialisés pour mesurer les valeurs d’absorbance de la longueur d’onde de la lumière UV ou visible. Il est considéré comme un instrument très précis, très sensible et donc extrêmement précis, en particulier pour déterminer le changement de couleur. Cette méthode est également pratique pour les expériences de laboratoire parce que c’est un processus peu coûteux et relativement simple.

Spectrophotométrie UV-visible
La plupart des spectrophotomètres sont utilisés dans les régions UV et visibles du spectre, et certains de ces instruments fonctionnent également dans la région du proche infrarouge. La concentration d’une protéine peut être estimée en mesurant la DO à 280 nm en raison de la présence de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine. Cette méthode n’est pas très précise puisque la composition des protéines varie considérablement et que les protéines sans aucun de ces acides aminés n’ont pas une absorption maximale à 280 nm. La contamination par les acides nucléiques peut également interférer. Cette méthode nécessite un spectrophotomètre capable de mesurer dans la région UV avec des cuvettes de quartz.

La spectroscopie ultraviolet-visible (UV-vis) implique des niveaux d’énergie qui excitent les transitions électroniques. L’absorption de la lumière UV-vis excite les molécules qui sont dans les états fondamentaux à leurs états excités

La spectrophotométrie de la région visible 400-700 nm est largement utilisée en science de la colorimétrie. Il est un fait connu qu’il fonctionne mieux à la gamme de 0,2-0,8 OD Les fabricants d’encre, les sociétés d’impression, les fournisseurs de textiles, et beaucoup d’autres, ont besoin des données fournies par colorimétrie. Ils prennent des mesures dans la région de tous les 5-20 nanomètres le long de la région visible, et produisent une courbe de réflectance spectrale ou un flux de données pour des présentations alternatives. Ces courbes peuvent être utilisées pour tester un nouveau lot de colorant afin de vérifier s’il correspond aux spécifications, par exemple les normes d’impression ISO.

Les spectrophotomètres à région visible traditionnels ne peuvent pas détecter si un colorant ou le matériau de base a une fluorescence. Cela peut rendre difficile la gestion des problèmes de couleur si, par exemple, une ou plusieurs des encres d’impression sont fluorescentes. Lorsqu’un colorant contient de la fluorescence, un spectrophotomètre fluorescent bi-spectral est utilisé. Il existe deux configurations majeures pour les spectrophotomètres à spectre visuel, d / 8 (sphérique) et 0/45. Les noms sont dus à la géométrie de la source lumineuse, de l’observateur et de l’intérieur de la chambre de mesure. Les scientifiques utilisent cet instrument pour mesurer la quantité de composés dans un échantillon. Si le composé est plus concentré, plus de lumière sera absorbée par l’échantillon; à l’intérieur de petites plages, la loi de Beer-Lambert se maintient et l’absorbance entre les échantillons varie linéairement avec la concentration. Dans le cas de mesures d’impression, deux réglages alternatifs sont couramment utilisés – sans / avec filtre UV pour mieux contrôler l’effet des azurants UV dans le stock de papier.

Les échantillons sont habituellement préparés dans des cuvettes; en fonction de la région d’intérêt, ils peuvent être construits en verre, en matière plastique (zone d’intérêt du spectre visible) ou en quartz (région d’intérêt du spectre UV lointain).

Applications
Estimation de la concentration de carbone organique dissous
Absorbance ultraviolette spécifique pour la métrique de l’aromaticité
Le test de Bial pour la concentration de pentoses
Application expérimentale
Comme décrit dans la section sur les applications, la spectrophotométrie peut être utilisée à la fois dans l’analyse qualitative et quantitative de l’ADN, de l’ARN et des protéines. Une analyse qualitative peut être utilisée et des spectrophotomètres sont utilisés pour enregistrer les spectres de composés en balayant de larges régions de longueur d’onde pour déterminer les propriétés d’absorbance (l’intensité de la couleur) du composé à chaque longueur d’onde. Une expérience qui peut démontrer les diverses utilisations que peut avoir la spectrophotométrie visible est la séparation de la ß-galactosidase d’un mélange de diverses protéines. En grande partie, la spectrophotométrie est mieux utilisée pour aider à quantifier la quantité de purification que votre échantillon a subi par rapport à la concentration totale de protéines. En effectuant une chromatographie d’affinité, vous pouvez isoler la B-galactosidase et cela peut être testé en faisant réagir les échantillons prélevés avec l’ONPG et en déterminant si l’échantillon devient jaune. Après avoir testé l’échantillon à 420 nm pour une interaction spécifique avec l’ONPG et à 595 pour un test de Bradford, la quantité de purification peut être évaluée quantitativement. En plus de cette spectrophotométrie peut être utilisé en tandem avec d’autres techniques telles que l’électrophorèse SDS-Page afin de purifier et isoler divers échantillons de protéines.

Spectrophotométrie IR
Les spectrophotomètres conçus pour la région infrarouge sont très différents en raison des exigences techniques de mesure dans cette région. Un facteur important est le type de photocapteurs qui sont disponibles pour différentes régions spectrales, mais la mesure infrarouge est également difficile car pratiquement tout émet de la lumière infrarouge sous forme de rayonnement thermique, en particulier à des longueurs d’onde supérieures à environ 5 um.

Une autre complication est que de nombreux matériaux tels que le verre et le plastique absorbent la lumière infrarouge, ce qui le rend incompatible en tant que support optique. Les matériaux optiques idéaux sont des sels qui n’absorbent pas fortement. Les échantillons pour spectrophotométrie IR peuvent être étalés entre deux disques de bromure de potassium ou broyés avec du bromure de potassium et pressés en une pastille. Lorsque des solutions aqueuses doivent être mesurées, du chlorure d’argent insoluble est utilisé pour construire la cellule.

Spectroradiomètres
Les spectroradiomètres, qui fonctionnent presque comme les spectrophotomètres de la région visible, sont conçus pour mesurer la densité spectrale des illuminants. Les applications peuvent inclure l’évaluation et la catégorisation de l’éclairage pour les ventes par le fabricant, ou pour les clients de confirmer la lampe qu’ils ont décidé d’acheter est dans leurs spécifications. Composants:

La source de lumière brille sur ou à travers l’échantillon.
L’échantillon transmet ou réfléchit la lumière.
Le détecteur détecte la quantité de lumière réfléchie ou transmise à travers l’échantillon.
Le détecteur convertit alors la quantité de lumière transmise ou réfléchie par l’échantillon en un nombre.