En química, la espectrofotometría es la medida cuantitativa de las propiedades de reflexión o transmisión de un material en función de la longitud de onda. Es más específico que el término general espectroscopia electromagnética en que la espectrofotometría trata con luz visible, casi ultravioleta e infrarrojo cercano, pero no cubre las técnicas espectroscópicas resueltas en el tiempo.
Visión de conjunto
La espectrofotometría es una herramienta que depende del análisis cuantitativo de las moléculas en función de la cantidad de luz absorbida por los compuestos coloreados. La espectrofotometría utiliza fotómetros, conocidos como espectrofotómetros, que pueden medir la intensidad de un rayo de luz en función de su color (longitud de onda). Las características importantes de los espectrofotómetros son el ancho de banda espectral (el rango de colores que puede transmitir a través de la muestra de prueba), el porcentaje de transmisión de muestra, el rango logarítmico de absorción de muestra y algunas veces un porcentaje de medición de reflectancia.
Un espectrofotómetro se usa comúnmente para medir la transmitancia o la reflectancia de soluciones, sólidos transparentes u opacos, como vidrio pulido o gases. Aunque muchos productos bioquímicos son coloreados, como en, absorben la luz visible y por lo tanto se pueden medir mediante procedimientos colorimétricos, incluso los productos bioquímicos incoloros a menudo pueden convertirse en compuestos coloreados adecuados para reacciones cromogénicas formadoras de color para producir compuestos adecuados para el análisis colorimétrico. Sin embargo, también pueden diseñarse para medir la difusividad en cualquiera de los rangos de luz listados que usualmente cubren alrededor de 200 nm – 2500 nm usando diferentes controles y calibraciones. Dentro de estos rangos de luz, se necesitan calibraciones en la máquina usando estándares que varían en tipo dependiendo de la longitud de onda de la determinación fotométrica.
Un ejemplo de un experimento en el que se usa espectrofotometría es la determinación de la constante de equilibrio de una solución. Una cierta reacción química dentro de una solución puede ocurrir en dirección hacia adelante y hacia atrás, donde los reactivos forman productos y los productos se descomponen en reactivos. En algún momento, esta reacción química alcanzará un punto de equilibrio llamado punto de equilibrio. Para determinar las concentraciones respectivas de reactivos y productos en este punto, la transmitancia de la luz de la solución puede probarse usando espectrofotometría. La cantidad de luz que pasa a través de la solución es indicativa de la concentración de ciertos químicos que no permiten el paso de la luz.
La absorción de la luz se debe a la interacción de la luz con los modos de moléculas electrónicas y vibratorias. Cada tipo de molécula tiene un conjunto individual de niveles de energía asociados con la composición de sus enlaces químicos y núcleos, y así absorberá la luz de longitudes de onda o energías específicas, dando como resultado propiedades espectrales únicas. Esto se basa en su composición específica y distinta.
El uso de espectrofotómetros abarca diversos campos científicos, como la física, la ciencia de los materiales, la química, la bioquímica y la biología molecular. Son ampliamente utilizados en muchas industrias, incluidos los semiconductores, la fabricación de láser y óptica, la impresión y el examen forense, así como en laboratorios para el estudio de sustancias químicas. La espectrofotometría se usa a menudo en mediciones de actividades enzimáticas, determinaciones de concentraciones de proteínas, determinaciones de constantes cinéticas enzimáticas y mediciones de reacciones de unión a ligandos. En última instancia, un espectrofotómetro puede determinar, dependiendo del control o la calibración, qué sustancias están presentes en un objetivo y exactamente cuánto a través de los cálculos de las longitudes de onda observadas.
En astronomía, el término espectrofotometría se refiere a la medición del espectro de un objeto celeste en el que la escala de flujo del espectro se calibra en función de la longitud de onda, generalmente en comparación con una observación de una estrella estándar espectrofotométrica, y corregida para la absorción de luz por la atmósfera de la Tierra.
Historia
En 1940, varios espectrofotómetros estaban disponibles en el mercado, pero los primeros modelos no podían funcionar en el ultravioleta. Arnold O. Beckman desarrolló una versión mejorada en National Technical Laboratories Company, más tarde Beckman Instrument Company y, finalmente, Beckman Coulter. Se desarrollaron los modelos A, B y C (se produjeron tres unidades del modelo C), luego el modelo D, que se convirtió en DU. Toda la electrónica estaba contenida dentro de la caja del instrumento, y tenía una nueva lámpara de hidrógeno con continuidad ultravioleta y un mejor monocromador. Este instrumento fue producido desde 1941 hasta 1976 con esencialmente el mismo diseño; se vendieron más de 30,000. El precio de 1941 fue de US $ 723 (los accesorios de ultravioleta fueron una opción a un costo adicional). El premio Nobel de Química Bruce Merrifield dijo que era «probablemente el instrumento más importante desarrollado para el avance de la biociencia».
Diseño
Hay dos clases principales de dispositivos: haz simple y doble haz. Un espectrofotómetro de doble haz compara la intensidad de la luz entre dos trayectorias de luz, una ruta que contiene una muestra de referencia y la otra la muestra de prueba. Un espectrofotómetro de haz simple mide la intensidad de luz relativa del haz antes y después de insertar una muestra de prueba. Aunque las mediciones de comparación de los instrumentos de doble haz son más fáciles y más estables, los instrumentos de haz simple pueden tener un rango dinámico más grande y son ópticamente más simples y compactos. Además, algunos instrumentos especializados, como los espectrofotómetros construidos en microscopios o telescopios, son instrumentos de haz único debido a su practicidad.
Históricamente, los espectrofotómetros utilizan un monocromador que contiene una rejilla de difracción para producir el espectro analítico. La rejilla puede ser movible o fija. Si se utiliza un solo detector, como un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo, la rejilla se puede escanear paso por paso para que el detector pueda medir la intensidad de la luz en cada longitud de onda (que corresponderá a cada «paso»). También se pueden usar matrices de detectores, tales como dispositivos de carga acoplada (CCD) o arreglos de fotodiodos (PDA). En tales sistemas, la rejilla es fija y la intensidad de cada longitud de onda de luz es medida por un detector diferente en la matriz. Además, la mayoría de los espectrofotómetros de infrarrojo medio modernos utilizan una técnica de transformada de Fourier para adquirir la información espectral. Esta técnica se llama espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier.
Al realizar mediciones de transmisión, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que pasa a través de una solución de referencia y una solución de prueba, luego compara electrónicamente las intensidades de las dos señales y calcula el porcentaje de transmisión de la muestra en comparación con el estándar de referencia. Para mediciones de reflectancia, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que se refleja a partir de las muestras de referencia y de prueba. La luz de la lámpara fuente pasa a través de un monocromador, que difracta la luz en un «arcoíris» de longitudes de onda a través de un prisma giratorio y produce anchuras de banda estrechas de este espectro difractado a través de una rendija mecánica en el lado de salida del monocromador. Estos anchos de banda se transmiten a través de la muestra de prueba. Luego, la densidad de flujo de fotones (vatios por metro cuadrado usualmente) de la luz transmitida o reflejada se mide con un fotodiodo, un dispositivo de carga acoplada u otro sensor de luz. El valor de transmitancia o reflectancia para cada longitud de onda de la muestra de ensayo se compara luego con los valores de transmisión o reflectancia de la muestra de referencia. La mayoría de los instrumentos aplicarán una función logarítmica a la relación de transmitancia lineal para calcular la «absorbencia» de la muestra, un valor que es proporcional a la «concentración» del químico que se mide.
En resumen, la secuencia de eventos en un espectrofotómetro moderno es la siguiente:
La fuente de luz se ilumina en un monocromador, se difracta en un arco iris y se divide en dos haces. Luego se escanea a través de la muestra y las soluciones de referencia.
Las fracciones de las longitudes de onda incidentes se transmiten a través de, o se reflejan a partir de, la muestra y la referencia.
La luz resultante golpea el dispositivo fotodetector, que compara la intensidad relativa de los dos haces.
Los circuitos electrónicos convierten las corrientes relativas en porcentajes de transmisión lineal y / o valores de absorbancia / concentración.
Muchos espectrofotómetros antiguos deben calibrarse mediante un procedimiento conocido como «puesta a cero», para equilibrar la salida de corriente nula de los dos haces en el detector. La transmisión de una sustancia de referencia se establece como un valor de referencia (referencia), de modo que la transmisión de todas las otras sustancias se registra con relación a la sustancia inicial «puesta a cero». El espectrofotómetro luego convierte la relación de transmisión en «absorbencia», la concentración de componentes específicos de la muestra de ensayo en relación con la sustancia inicial.
Aplicaciones en bioquímica
La espectrofotometría es una técnica importante utilizada en muchos experimentos bioquímicos que implican aislamiento de ADN, ARN y proteínas, cinética enzimática y análisis bioquímicos. Una breve explicación del procedimiento de espectrofotometría incluye comparar la absorbencia de una muestra en blanco que no contiene un compuesto coloreado con una muestra que contiene un compuesto coloreado. Esta coloración puede realizarse mediante un tinte tal como el colorante Coomasie Brilliant Blue G-250 medido a 595 nm o mediante una reacción enzimática como se ve entre la β-galactosidasa y ONPG (muestra el amarillo de la muestra) medida a 420 nm. El espectrofotómetro se utiliza para medir compuestos coloreados en la región visible de la luz (entre 350 nm y 800 nm), por lo que se puede utilizar para encontrar más información sobre la sustancia que se estudia. En experimentos bioquímicos, se elige una propiedad química y / o física y el procedimiento que se usa es específico de esa propiedad para obtener más información sobre la muestra, como la cantidad, pureza, actividad enzimática, etc. La espectrofotometría se puede usar para una serie de técnicas tales como determinar la absorbancia de longitud de onda óptima de las muestras, determinar el pH óptimo para la absorbancia de las muestras, determinar las concentraciones de muestras desconocidas y determinar el pKa de varias muestras. La espectrofotometría también es un proceso útil para la purificación de proteínas y también se puede usar como método para crear ensayos ópticos de un compuesto. Los datos espectrofotométricos también pueden usarse junto con la ecuación de Beer-Lambert, A = -log10T = εcl = OD, con el fin de determinar diversas relaciones entre la transmitancia y la concentración, y la absorbancia y la concentración. Debido a que un espectrofotómetro mide la longitud de onda de un compuesto a través de su color, se puede agregar una sustancia de unión de colorante para que pueda sufrir un cambio de color y medirse. Es posible conocer las concentraciones de una mezcla de dos componentes utilizando los espectros de absorción de las soluciones estándar de cada componente. Para hacer esto, es necesario conocer el coeficiente de extinción de esta mezcla en dos longitudes de onda y los coeficientes de extinción de las soluciones que contienen los pesos conocidos de los dos componentes. Los espectrofotómetros se han desarrollado y mejorado durante décadas y se han utilizado ampliamente entre los químicos. Además, los espectrofotómetros están especializados para medir valores de absorbancia de longitud de onda de luz UV o visible. Se considera que es un instrumento muy preciso que también es muy sensible y, por lo tanto, extremadamente preciso, especialmente en la determinación del cambio de color. Este método también es conveniente para usar en experimentos de laboratorio porque es un proceso económico y relativamente simple.
Espectrofotometría UV-visible
La mayoría de los espectrofotómetros se utilizan en las regiones UV y visibles del espectro, y algunos de estos instrumentos también operan en la región del infrarrojo cercano. La concentración de una proteína puede estimarse midiendo la DO a 280 nm debido a la presencia de triptófano, tirosina y fenilalanina. Este método no es muy preciso ya que la composición de las proteínas varía mucho y las proteínas con ninguno de estos aminoácidos no tienen una absorción máxima a 280 nm. La contaminación con ácido nucleico también puede interferir. Este método requiere un espectrofotómetro capaz de medir en la región UV con cubetas de cuarzo.
La espectroscopía ultravioleta-visible (UV-vis) involucra niveles de energía que excitan las transiciones electrónicas. La absorción de la luz UV-vis excita las moléculas que se encuentran en los estados base a sus estados excitados
La espectrofotometría de 400-700 nm de la región visible se utiliza ampliamente en la ciencia de la colorimetría. Es un hecho conocido que opera mejor en el rango de 0.2-0.8. Los fabricantes de tinta OD, las compañías de impresión, los vendedores de textiles y muchos más necesitan los datos proporcionados a través de la colorimetría. Toman lecturas en la región de cada 5-20 nanómetros a lo largo de la región visible, y producen una curva de reflectancia espectral o una secuencia de datos para presentaciones alternativas. Estas curvas se pueden usar para probar un nuevo lote de colorante y comprobar si cumple las especificaciones, por ejemplo, los estándares de impresión ISO.
Los espectrofotómetros de la región visible tradicional no pueden detectar si un colorante o el material base tiene fluorescencia. Esto puede dificultar la administración de problemas de color si, por ejemplo, una o más de las tintas de impresión son fluorescentes. Cuando un colorante contiene fluorescencia, se usa un espectrofotómetro fluorescente biespectral. Hay dos configuraciones principales para espectrofotómetros de espectro visual, d / 8 (esférico) y 0/45. Los nombres se deben a la geometría de la fuente de luz, el observador y el interior de la cámara de medición. Los científicos usan este instrumento para medir la cantidad de compuestos en una muestra. Si el compuesto está más concentrado, la muestra absorberá más luz; dentro de rangos pequeños, la ley de Beer-Lambert se cumple y la absorbancia entre las muestras varía linealmente con la concentración. En el caso de las mediciones de impresión, se usan comúnmente dos configuraciones alternativas, sin / con filtro UV para controlar mejor el efecto de los abrillantadores UV dentro del stock de papel.
Las muestras generalmente se preparan en cubetas; dependiendo de la región de interés, pueden construirse de vidrio, plástico (región de interés visible del espectro) o cuarzo (región de interés del espectro UV lejano).
Aplicaciones
Estimación de la concentración de carbono orgánico disuelto
Absorbancia ultravioleta específica para la métrica de la aromaticidad
Prueba de Bial para la concentración de pentosas
Aplicación experimental
Como se describe en la sección de aplicaciones, la espectrofotometría se puede utilizar en análisis cualitativos y cuantitativos de ADN, ARN y proteínas. Se puede usar el análisis cualitativo y los espectrofotómetros se usan para registrar los espectros de escaneo de regiones de longitud de onda amplia para determinar las propiedades de absorbancia (la intensidad del color) del compuesto en cada longitud de onda. Un experimento que puede demostrar los diversos usos que puede tener la espectrofotometría visible es la separación de β-galactosidasa de una mezcla de varias proteínas. En gran parte, la espectrofotometría se utiliza mejor para ayudar a cuantificar la cantidad de purificación que ha experimentado su muestra en relación con la concentración total de proteína. Al ejecutar una cromatografía de afinidad, puede aislar B-galactosidasa y esto puede probarse haciendo reaccionar las muestras recolectadas con ONPG y determinando si la muestra se vuelve amarilla. Después de esta prueba, la muestra a 420 nm para interacción específica con ONPG y a 595 para un ensayo Bradford, la cantidad de purificación puede evaluarse cuantitativamente. Además de esta espectrofotometría se puede utilizar en tándem con otras técnicas como electroforesis SDS-Page con el fin de purificar y aislar varias muestras de proteínas.
Espectrofotometría IR
Los espectrofotómetros diseñados para la región infrarroja son bastante diferentes debido a los requisitos técnicos de medición en esa región. Un factor importante es el tipo de fotosensores que están disponibles para diferentes regiones espectrales, pero la medición infrarroja también es un desafío porque prácticamente todo emite luz IR como radiación térmica, especialmente en longitudes de onda superiores a aproximadamente 5 μm.
Otra complicación es que bastantes materiales, como el vidrio y el plástico, absorben la luz infrarroja, por lo que es incompatible como medio óptico. Los materiales ópticos ideales son sales que no absorben fuertemente. Las muestras para la espectrofotometría IR se pueden untar entre dos discos de bromuro de potasio o se muelen con bromuro de potasio y se prensan en un sedimento. Cuando se deben medir soluciones acuosas, se usa cloruro de plata insoluble para construir la célula.
Espectrorradiómetros
Los espectrorradiómetros, que funcionan casi como los espectrofotómetros de la región visible, están diseñados para medir la densidad espectral de los iluminantes. Las aplicaciones pueden incluir la evaluación y categorización de iluminación para ventas por parte del fabricante, o para que los clientes confirmen que la lámpara que decidieron comprar está dentro de sus especificaciones. Componentes:
La fuente de luz brilla sobre o a través de la muestra.
La muestra transmite o refleja la luz.
El detector detecta cuánta luz se refleja o se transmite a través de la muestra.
El detector luego convierte la cantidad de luz que la muestra transmitió o reflejó en un número.