In der Chemie ist die Spektrophotometrie die quantitative Messung der Reflexions- oder Transmissionseigenschaften eines Materials als Funktion der Wellenlänge. Sie ist spezifischer als der allgemeine Begriff der elektromagnetischen Spektroskopie, da sich die Spektrophotometrie mit sichtbarem Licht, nahem Ultraviolett und nahem Infrarot befasst, aber zeitaufgelöste spektroskopische Techniken nicht abdeckt.

Überblick
Die Spektrophotometrie ist ein Werkzeug, das von der quantitativen Analyse von Molekülen abhängt, abhängig davon, wie viel Licht von farbigen Verbindungen absorbiert wird. Die Spektrophotometrie verwendet Photometer, sogenannte Spektrophotometer, die die Intensität eines Lichtstrahls als Funktion seiner Farbe (Wellenlänge) messen können. Wichtige Merkmale von Spektralphotometern sind die spektrale Bandbreite (der Bereich von Farben, die es durch die Testprobe übertragen kann), der Prozentsatz der Probenübertragung, der logarithmische Bereich der Probenabsorption und manchmal ein Prozentsatz der Reflexionsmessung.

Ein Spektrophotometer wird üblicherweise zur Messung der Durchlässigkeit oder Reflexion von Lösungen, transparenten oder opaken Feststoffen, wie poliertem Glas oder Gasen, verwendet. Obwohl viele Biochemikalien gefärbt sind, wie sie, absorbieren sie sichtbares Licht und können daher durch kolorimetrische Verfahren gemessen werden, selbst farblose Biochemikalien können oft in gefärbte Verbindungen umgewandelt werden, die für chromogene Farbbildungsreaktionen geeignet sind, um Verbindungen zu ergeben, die für eine colorimetrische Analyse geeignet sind. Sie können jedoch auch so konstruiert werden, dass sie die Diffusivität in einem der aufgeführten Lichtbereiche, die normalerweise zwischen 200 nm und 2500 nm liegen, unter Verwendung verschiedener Steuerungen und Kalibrierungen messen. Innerhalb dieser Lichtbereiche werden Kalibrierungen an der Maschine unter Verwendung von Standards benötigt, die abhängig von der Wellenlänge der photometrischen Bestimmung in ihrem Typ variieren.

Ein Beispiel für ein Experiment, bei dem Spektrophotometrie verwendet wird, ist die Bestimmung der Gleichgewichtskonstante einer Lösung. Eine bestimmte chemische Reaktion in einer Lösung kann in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung auftreten, wobei Reaktanten Produkte bilden und Produkte in Reaktanten zerfallen. Irgendwann wird diese chemische Reaktion einen Gleichgewichtspunkt erreichen, der Gleichgewichtspunkt genannt wird. Um die jeweiligen Konzentrationen von Reaktanten und Produkten an diesem Punkt zu bestimmen, kann die Lichtdurchlässigkeit der Lösung unter Verwendung von Spektrophotometrie getestet werden. Die Menge an Licht, die durch die Lösung hindurchgeht, ist ein Hinweis auf die Konzentration bestimmter Chemikalien, die kein Licht durchlassen.

Die Absorption von Licht beruht auf der Wechselwirkung von Licht mit den elektronischen und Schwingungsmoden von Molekülen. Jede Art von Molekül hat eine individuelle Menge von Energieniveaus, die mit der Zusammensetzung seiner chemischen Bindungen und Kerne verbunden sind, und absorbiert somit Licht bestimmter Wellenlängen oder Energien, was zu einzigartigen spektralen Eigenschaften führt. Dies basiert auf seiner spezifischen und unterschiedlichen Zusammensetzung.

Der Einsatz von Spektralphotometern umfasst verschiedene wissenschaftliche Gebiete wie Physik, Materialwissenschaften, Chemie, Biochemie und Molekularbiologie. Sie werden in vielen Industriezweigen einschließlich Halbleiter, Laser- und optischer Herstellung, Drucken und forensischer Untersuchung sowie in Laboratorien für das Studium chemischer Substanzen weit verbreitet verwendet. Spektrophotometrie wird häufig bei Messungen von Enzymaktivitäten, Bestimmungen von Proteinkonzentrationen, Bestimmungen von enzymatischen kinetischen Konstanten und Messungen von Ligandenbindungsreaktionen verwendet. Letztlich ist ein Spektrophotometer in der Lage, abhängig von der Steuerung oder Kalibrierung zu bestimmen, welche Substanzen in einem Ziel vorhanden sind und wie genau durch Berechnungen von beobachteten Wellenlängen.

In der Astronomie bezieht sich der Begriff Spektrophotometrie auf die Messung des Spektrums eines Himmelsobjektes, bei dem die Flußskala des Spektrums als eine Funktion der Wellenlänge kalibriert wird, üblicherweise durch Vergleich mit einer Beobachtung eines spektrophotometrischen Standardsterns und korrigiert für die Absorption von Licht durch die Erdatmosphäre.

Geschichte
Bis 1940 waren mehrere Spektrophotometer auf dem Markt erhältlich, aber frühe Modelle konnten nicht im Ultravioletten arbeiten. Arnold O. Beckman entwickelte eine verbesserte Version bei der National Technical Laboratories Company, später der Beckman Instrument Company und schließlich Beckman Coulter. Die Modelle A, B und C wurden entwickelt (drei Einheiten von Modell C wurden hergestellt), dann das Modell D, das zu DU wurde. Die ganze Elektronik war in dem Instrumentenkoffer enthalten, und es hatte eine neue Wasserstofflampe mit ultraviolettem Kontinuum und einen besseren Monochromator. Dieses Instrument wurde von 1941 bis 1976 im wesentlichen in gleicher Ausführung hergestellt; über 30.000 wurden verkauft. 1941 Preis war US $ 723 (Fern-UV-Zubehör war eine Option gegen Aufpreis). Der Nobelpreisträger Bruce Merrifield sagte, es sei „wahrscheinlich das wichtigste Instrument, das jemals zur Förderung der Biowissenschaften entwickelt wurde“.

Design
Es gibt zwei Hauptklassen von Geräten: Einzelstrahl und Doppelstrahl. Ein Doppelstrahl-Spektrophotometer vergleicht die Lichtintensität zwischen zwei Lichtpfaden, wobei ein Weg eine Referenzprobe und der andere die Testprobe enthält. Ein Einstrahl-Spektrophotometer misst die relative Lichtintensität des Strahls vor und nach dem Einlegen einer Testprobe. Obwohl Vergleichsmessungen von zweistrahligen Instrumenten einfacher und stabiler sind, können Einstrahlinstrumente einen größeren dynamischen Bereich haben und sind optisch einfacher und kompakter. Darüber hinaus sind einige spezialisierte Instrumente, wie zum Beispiel Spektrophotometer, die auf Mikroskopen oder Teleskopen aufgebaut sind, aus praktischen Gründen Einzelstrahlinstrumente.

Historisch verwenden Spektrophotometer einen Monochromator, der ein Beugungsgitter enthält, um das analytische Spektrum zu erzeugen. Das Gitter kann entweder beweglich oder feststehend sein. Wenn ein einzelner Detektor, wie beispielsweise eine Photovervielfacherröhre oder eine Photodiode, verwendet wird, kann das Gitter schrittweise abgetastet werden, so daß der Detektor die Lichtintensität bei jeder Wellenlänge messen kann (die jeder „Stufe“ entspricht). Arrays von Detektoren, wie etwa ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCD) oder Photodiodenarrays (PDA) können ebenfalls verwendet werden. In solchen Systemen ist das Gitter fixiert und die Intensität jeder Wellenlänge des Lichts wird durch einen anderen Detektor in der Anordnung gemessen. Zusätzlich verwenden die meisten modernen Infrarotspektrophotometer eine Fourier-Transformationstechnik, um die Spektralinformation zu erfassen. Diese Technik wird als Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie bezeichnet.

Wenn Transmissionsmessungen durchgeführt werden, vergleicht das Spektrophotometer quantitativ den Lichtanteil, der eine Referenzlösung und eine Testlösung durchläuft, vergleicht elektronisch die Intensitäten der beiden Signale und berechnet den Prozentsatz der Transmission der Probe im Vergleich zum Referenzstandard. Bei Reflexionsmessungen vergleicht das Spektralphotometer quantitativ den Lichtanteil, der von der Referenz- und der Testprobe reflektiert wird. Licht von der Quellenlampe wird durch einen Monochromator geleitet, der das Licht durch ein rotierendes Prisma in einen „Regenbogen“ von Wellenlängen beugt und schmale Bandbreiten dieses gebeugten Spektrums durch einen mechanischen Schlitz auf der Ausgangsseite des Monochromators ausgibt. Diese Bandbreiten werden durch die Testprobe übertragen. Dann wird die Photonenflussdichte (in der Regel Watt pro Quadratmeter) des transmittierten oder reflektierten Lichts mit einer Photodiode, einem ladungsgekoppelten Bauelement oder einem anderen Lichtsensor gemessen. Der Durchlässigkeits- oder Reflexionsgradwert für jede Wellenlänge der Testprobe wird dann mit den Transmissions- oder Reflexionswerten von der Referenzprobe verglichen. Die meisten Instrumente wenden eine logarithmische Funktion auf das lineare Transmissionsverhältnis an, um die „Absorption“ der Probe zu berechnen, ein Wert, der proportional zur „Konzentration“ der zu messenden Chemikalie ist.

Kurz gesagt, die Abfolge von Ereignissen in einem modernen Spektrophotometer ist wie folgt:

Die Lichtquelle wird in einen Monochromator gestrahlt, in einen Regenbogen gebeugt und in zwei Strahlen aufgeteilt. Es wird dann durch die Probe und die Referenzlösungen gescannt.
Brüche der einfallenden Wellenlängen werden durch die Probe und die Referenz übertragen oder von dieser reflektiert.
Das resultierende Licht trifft auf die Photodetektorvorrichtung, die die relative Intensität der zwei Strahlen vergleicht.
Elektronische Schaltungen wandeln die relativen Ströme in lineare Transmissionsprozentsätze und / oder Absorptions- / Konzentrationswerte um.
Viele ältere Spektrophotometer müssen durch ein als „Nullstellen“ bekanntes Verfahren kalibriert werden, um den Nullstromausgang der zwei Strahlen am Detektor auszugleichen. Die Übertragung einer Referenzsubstanz wird als Basiswert (Bezugswert) eingestellt, sodass die Übertragung aller anderen Substanzen relativ zur ursprünglichen „Null“ -Substanz aufgezeichnet wird. Das Spektrophotometer wandelt dann das Transmissionsverhältnis in „Absorption“ um, die Konzentration spezifischer Komponenten der Testprobe relativ zur Ausgangssubstanz.

Anwendungen in der Biochemie
Spektrophotometrie ist eine wichtige Technik, die in vielen biochemischen Experimenten verwendet wird, die DNA-, RNA- und Proteinisolierung, Enzymkinetik und biochemische Analysen umfassen. Eine kurze Erläuterung des Verfahrens der Spektrophotometrie umfaßt den Vergleich der Absorptionsfähigkeit einer Blindprobe, die keine gefärbte Verbindung enthält, mit einer Probe, die eine gefärbte Verbindung enthält. Diese Färbung kann entweder mit einem Farbstoff wie Coomasie Brilliant Blue G-250, gemessen bei 595 nm, oder mit einer enzymatischen Reaktion, wie zwischen β-Galactosidase und ONPG gesehen (wird Probe gelb), gemessen bei 420 nm, durchgeführt werden. Mit dem Spektralphotometer können farbige Verbindungen im sichtbaren Bereich des Lichts (zwischen 350 nm und 800 nm) gemessen werden, um mehr Informationen über die zu untersuchende Substanz zu erhalten. In biochemischen Experimenten wird eine chemische und / oder physikalische Eigenschaft gewählt, und das verwendete Verfahren ist spezifisch für diese Eigenschaft, um mehr Informationen über die Probe, wie die Menge, Reinheit, Enzymaktivität usw., zu erhalten. Spektrophotometrie kann verwendet werden für eine Anzahl von Techniken, wie das Bestimmen der optimalen Wellenlängenabsorption von Proben, das Bestimmen des optimalen pH-Werts für die Extinktion von Proben, das Bestimmen von Konzentrationen unbekannter Proben und das Bestimmen des pKa verschiedener Proben. Die Spektrophotometrie ist auch ein hilfreicher Prozess für die Proteinreinigung und kann auch als eine Methode zum Erstellen optischer Assays einer Verbindung verwendet werden. Spektrophotometrische Daten können auch in Verbindung mit der Beer-Lambert-Gleichung A = -log10T = εcl = OD verwendet werden, um verschiedene Beziehungen zwischen Durchlässigkeit und Konzentration sowie Absorption und Konzentration zu bestimmen. Da ein Spektrophotometer die Wellenlänge einer Verbindung durch ihre Farbe misst, kann eine Farbstoff bindende Substanz hinzugefügt werden, so dass sie eine Farbänderung erfahren kann und gemessen werden kann. Es ist möglich, die Konzentrationen einer Zweikomponentenmischung unter Verwendung der Absorptionsspektren der Standardlösungen jeder Komponente zu kennen. Um dies zu tun, ist es notwendig, den Extinktionskoeffizienten dieser Mischung bei zwei Wellenlängen und die Extinktionskoeffizienten von Lösungen zu kennen, die die bekannten Gewichte der zwei Komponenten enthalten. Spektrophotometer wurden über Jahrzehnte entwickelt und verbessert und sind unter Chemikern weit verbreitet. Darüber hinaus sind Spektralphotometer darauf spezialisiert, entweder UV- oder sichtbare Wellenlängen-Absorptionswerte zu messen. Es wird als sehr genaues Instrument angesehen, das auch sehr empfindlich und daher äußerst präzise ist, insbesondere bei der Bestimmung des Farbwechsels. Dieses Verfahren ist auch zur Verwendung in Laborexperimenten geeignet, da es ein kostengünstiger und relativ einfacher Prozess ist.

UV-sichtbare Spektrophotometrie
Die meisten Spektrophotometer werden im UV- und im sichtbaren Bereich des Spektrums verwendet, und einige dieser Instrumente arbeiten auch im nahen Infrarotbereich. Die Konzentration eines Proteins kann durch Messen der OD bei 280 nm aufgrund der Anwesenheit von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin abgeschätzt werden. Diese Methode ist nicht sehr genau, da die Zusammensetzung der Proteine ​​stark variiert und Proteine ​​mit keiner dieser Aminosäuren keine maximale Absorption bei 280 nm aufweisen. Nukleinsäure-Kontamination kann ebenfalls stören. Diese Methode erfordert ein Spektrophotometer, das im UV-Bereich mit Quarzküvetten messen kann.

Ultraviolett-sichtbare (UV-vis) Spektroskopie beinhaltet Energieniveaus, die elektronische Übergänge anregen. Die Absorption von UV-vis-Licht regt Moleküle, die in Grundzuständen sind, zu ihren angeregten Zuständen an

Spektralphotometrie mit einem sichtbaren Bereich von 400-700 nm wird ausgiebig in der Farbmetrikwissenschaft verwendet. Es ist eine bekannte Tatsache, dass es im Bereich von 0,2-0,8 am besten funktioniert. Tintenhersteller, Druckereien, Textilverkäufer und viele mehr benötigen die durch die Kolorimetrie bereitgestellten Daten. Sie nehmen Messungen im Bereich von jeweils 5-20 Nanometern entlang des sichtbaren Bereichs vor und erzeugen eine Spektralreflexionskurve oder einen Datenstrom für alternative Darstellungen. Diese Kurven können verwendet werden, um eine neue Farbstoffcharge zu testen, um zu überprüfen, ob sie den Spezifikationen entspricht, z. B. ISO-Druckstandards.

Herkömmliche Spektrophotometer im sichtbaren Bereich können nicht feststellen, ob ein Farbstoff oder das Basismaterial Fluoreszenz aufweist. Dies kann die Verwaltung von Farbproblemen erschweren, wenn beispielsweise eine oder mehrere Druckfarben fluoreszierend sind. Wenn ein Farbstoff Fluoreszenz enthält, wird ein bi-spektrales Fluoreszenzspektrophotometer verwendet. Es gibt zwei Hauptkonfigurationen für spektrale Spektralphotometer, d / 8 (sphärisch) und 0/45. Die Namen beruhen auf der Geometrie der Lichtquelle, des Beobachters und des Inneren der Messkammer. Wissenschaftler verwenden dieses Instrument, um die Menge an Verbindungen in einer Probe zu messen. Wenn die Verbindung konzentrierter ist, wird mehr Licht von der Probe absorbiert; in kleinen Bereichen gilt das Beer-Lambert-Gesetz, und die Extinktion zwischen Proben variiert linear mit der Konzentration. Im Falle von Druckmessungen werden üblicherweise zwei alternative Einstellungen verwendet – ohne / mit UV-Filter, um die Wirkung von UV-Aufhellern innerhalb des Papiermaterials besser zu kontrollieren.

Proben werden normalerweise in Küvetten vorbereitet; abhängig von der interessierenden Region können sie aus Glas, Kunststoff (interessierende sichtbare Spektralregion) oder Quarz (interessierende Region des fernen UV-Spektrums) aufgebaut sein.

Anwendungen
Abschätzung der gelösten organischen Kohlenstoffkonzentration
Spezifische Ultraviolettabsorption für die Metrik der Aromatizität
Bial-Test zur Konzentration von Pentosen
Experimentelle Anwendung
Wie im Anwendungsabschnitt beschrieben, kann die Spektrophotometrie sowohl bei der qualitativen als auch bei der quantitativen Analyse von DNA, RNA und Proteinen verwendet werden. Qualitative Analyse kann verwendet werden, und Spektrophotometer werden verwendet, um Spektren von Verbindungen durch Scannen von breiten Wellenlängenbereichen aufzuzeichnen, um die Absorptionseigenschaften (die Intensität der Farbe) der Verbindung bei jeder Wellenlänge zu bestimmen. Ein Experiment, das die verschiedenen Verwendungen zeigen kann, die die sichtbare Spektrophotometrie haben kann, ist die Trennung von & beta; -Galactosidase von einer Mischung verschiedener Proteine. Hauptsächlich wird die Spektrophotometrie am besten verwendet, um die Menge der Reinigung zu quantifizieren, die Ihre Probe im Verhältnis zur Gesamtproteinkonzentration durchlaufen hat. Durch Ausführen einer Affinitätschromatographie können Sie B-Galactosidase isolieren, und dies kann getestet werden, indem die gesammelten Proben mit ONPG reagieren und festgestellt wird, ob die Probe gelb wird. Nach diesem Testen der Probe bei 420 nm für eine spezifische Wechselwirkung mit ONPG und bei 595 für einen Bradford-Test kann die Reinigungsmenge quantitativ bestimmt werden. Zusätzlich zu dieser Spektrophotometrie kann in Kombination mit anderen Techniken wie SDS-Page-Elektrophorese verwendet werden, um verschiedene Proteinproben zu reinigen und zu isolieren.

IR-Spektrophotometrie
Spektralphotometer, die für den Infrarotbereich ausgelegt sind, sind aufgrund der technischen Anforderungen der Messung in diesem Bereich sehr unterschiedlich. Ein Hauptfaktor ist die Art von Photosensoren, die für verschiedene Spektralbereiche verfügbar sind, aber auch die Infrarotmessung ist eine Herausforderung, da praktisch alles IR-Licht als Wärmestrahlung aussendet, insbesondere bei Wellenlängen jenseits von etwa 5 um.

Eine weitere Komplikation besteht darin, dass einige Materialien wie Glas und Kunststoff Infrarotlicht absorbieren, wodurch es als optisches Medium inkompatibel ist. Ideale optische Materialien sind Salze, die nicht stark absorbieren. Proben für die IR-Spektrophotometrie können zwischen zwei Scheiben Kaliumbromid ausgestrichen oder mit Kaliumbromid gemahlen und zu einem Pellet gepresst werden. Wenn wässrige Lösungen gemessen werden sollen, wird unlösliches Silberchlorid zum Aufbau der Zelle verwendet.

Spektroradiometer
Spektralradiometer, die fast wie die Spektrophotometer im sichtbaren Bereich arbeiten, dienen zur Messung der spektralen Dichte von Leuchtmitteln. Zu den Anwendungen kann die Bewertung und Kategorisierung von Beleuchtung für den Verkauf durch den Hersteller gehören, oder die Kunden müssen bestätigen, dass die Lampe, die sie gekauft haben, ihren Spezifikationen entspricht. Komponenten:

Die Lichtquelle scheint auf oder durch die Probe.
Die Probe sendet oder reflektiert Licht.
Der Detektor erfasst, wie viel Licht von der Probe reflektiert oder übertragen wurde.
Der Detektor konvertiert dann, wieviel Licht die Probe in eine Zahl übertragen oder reflektiert hat.